酯化法提取生物基丁二酸

叶小金，宫 莉，王红蕾，王晓俊，徐洪章，薛冬桦

（长春工业大学化学与生命科学学院，吉林 长春130012）

丁二酸又称琥珀酸，是一种重要的有机化合物，广泛应用于医药、农药、染料、香料、食品等领域［1－2］。工业级丁二酸主要通过化学法合成，不仅污染严重，而且所用原料是不可再生的石油化工产品［3－4］。因此，在石油资源日益枯竭的今天，环境友好的生物发酵法产丁二酸越来越引起重视［5－6］。

提取生物基丁二酸大多采用钙盐法，即在发酵液中加入钙离子形成丁二酸钙盐沉淀，以达到分离丁二酸的目的，但其收率和纯度并不理想［7］。络合萃取法是通过萃取分离发酵液中丁二酸，然后反萃，获得目标产物生物基丁二酸，该法污染环境，成本较高［8－9］。基于丁二酸在pH≤2、温度为0～4℃时，溶解度降低，可通过酸结晶法析出丁二酸晶体，但收率和纯度较低［10］。因此，高效分离纯化发酵液中丁二酸成为研究热点。

作者根据丁二酸盐在有机溶剂中的溶解度，经酸化与酯化分离纯化丁二酸，拟为生物发酵法产丁二酸的产业化奠定基础。

1 实验

1．1 原理

生物发酵法产丁二酸的发酵液中，丁二酸以盐的形式存在（微溶于醇溶剂），加酸使丁二酸盐酸化为丁二酸与水合盐（不溶于醇溶剂），加入醇溶剂后盐析形成沉淀，同时丁二酸与醇溶剂发生酯化反应，溶于醇溶剂中。此酯化反应是可逆反应，将醇溶剂蒸馏除去，余下的晶体即为生物基丁二酸。反应式如下：

反应式（1）、（2）均为可逆反应，当醇过量时，反应向正反应方向进行；当醇不足时，反应向逆反应方向进行，由此达到分离纯化生物基丁二酸的目的。

1．2 方法

1．2．1 丁二酸的制备

以玉米秸秆水解液为碳源，菌株Actinobacillus succinogenes X－1深层厌氧发酵获得丁二酸发酵液，离心去除菌体，用活性炭吸附残余色素等杂质，经蒸馏浓缩为固体。

1．2．2 测试与表征

3）红外光谱分析

生物基丁二酸的红外光谱分析采用Perkin－Elmer Spectrum One型傅立叶变换红外光谱仪。测试前，样品在50℃下干燥24h，KBr压片。分辨率为4cm－1，扫描范围为4 000～450cm－1。

4）X－射线衍射（XRD）分析

采用北京普析通用型X－射线衍射仪对生物基丁二酸进行表征。Cuκα 射线，Ni片滤波，λ＝0．154 nm，扫描范围：2θ＝15°～50°，步进扫描：Δ2θ＝4°·min－1。

5）扫描电子显微镜（SEM）分析

采用JSM－5600型扫描电子显微镜对生物基丁二酸的微观形貌进行分析，测试电压0～25kV，分辨率30mm。

2 结果与讨论

1）浓度分析

应用Waters 600系统HPLC，流动相为5mmol·L－1硫酸，色谱柱为 Waters C18色谱柱（150mm×3．9mm）。利用 Waters 2487紫外检测器进行检测，检测波长为210nm，进样量为10μL，采用外标法进行定量分析。

2）丁二酸纯度的测定

取一定质量（m）生物基丁二酸晶体，加入一定体积（V）水完全溶解后，测定溶液中丁二酸的浓度（c），按下式计算丁二酸纯度（W）：

2．1 丁二酸二钠在乙醇中的溶解度

在丁二酸发酵过程中，要加缓冲剂以维持内环境的pH值，达到丁二酸的持续积累［11］。但缓冲剂中含有的金属离子以丁二酸盐形式存在于发酵液中，影响丁二酸的分离纯化。利用酸化后水合盐不溶于醇溶剂的性质，可将金属离子与丁二酸分离，达到纯化丁二酸的目的。

不同温度下，丁二酸二钠在不同体积分数乙醇中的溶解度见图1。

由图1可知，当乙醇体积分数大于80%时，丁二酸二钠的溶解度小于0．1g·（100g）－1，不同温度下，丁二酸二钠溶解度变化不大；当乙醇体积分数小于80%时，丁二酸二钠的溶解度均显著提高。文献［11］报道，乙醇体积分数大于60%时，水合硫酸钠在乙醇中的溶解度小于0．1g·（100g）－1。与以无水乙醇或水为溶剂相比，丁二酸更易溶于一定体积分数的乙醇溶剂中［12－13］。综合考虑，当乙醇体积分数为80%时，丁二酸二钠和水合硫酸钠都微溶，丁二酸溶解度变大，有利于丁二酸的分离。

图1 丁二酸二钠在不同体积分数乙醇中的溶解度Fig．1 Solubility of Na2Succ in ethanol with different volume fractions

2．2 生物基丁二酸酯化工艺条件的优化

通过正交实验考察丁二酸盐种类（A）、氢离子与丁二酸盐的物质的量比（B）及反应时间（C）对丁二酸收率的影响，结果见表1。

表1 正交实验结果与分析Tab．1Results and analysis of orthogonal experiment

由表1可知，各因素对生物基丁二酸收率的影响大小依次为：丁二酸盐种类＞氢离子与丁二酸盐的物质的量比＞反应时间。最优的酯化工艺条件为A1B2C2，即丁二酸盐为丁二酸二钠、氢离子与丁二酸二钠的物质的量比为2．2∶1、反应时间为12h，在此条件下，生物基丁二酸的收率为91．7%。

2．3 生物基丁二酸纯化工艺条件的优化

玉米秸秆水解液发酵提取的生物基丁二酸含有杂质及色素，需加活性炭进行吸附纯化生物基丁二酸。在单因素实验基础上，利用Box－Behnken中心组合设计实验，选定活性炭加量（A′）、脱色温度（B′）和脱色时间（C′）3个因素为变量，各选取3个水平，目标参数为生物基丁二酸纯度。

2．3．1 生物基丁二酸纯化回归模型建立及方差分析

生物基丁二酸纯化工艺响应面实验设计及结果见表2。利用Design Expert 7．0软件对表2数据进行多元回归分析，二阶响应面模型结果方差分析见表3。

表2 生物基丁二酸纯化工艺响应面实验设计及结果Tab．2 Design and results of response surface analysis of purification process of bio－based succinic acid

通常P值小于0．05为显著［14］。由表3可知：各因素对生物基丁二酸纯度影响的大小依次为：脱色时间＞脱色温度＞活性炭加量。模型的P值小于0．0001，可见该模型为高度显著；失拟项的F值为4．00，表明该方程的拟合效果较好；A′、B′、C′、A′2、B′2和 C′26项为高度显著，A′B′为不显著，其它项为显著；失拟项P＝0．1067＞0．05，失拟检验结果不显著，表明该模型与数据拟合较好，实验误差小，可用于生物基丁二酸纯化结果的分析和预测。拟合二元多项回归方程为：Y＝97．62＋2．85A′＋3．45B′＋3．78C′0．20A′B′－1．00A′C′－0．55B′C′－7．91A′2－6．71B′2－5．01C′2，其中Y为响应值，即生物基丁二酸纯度。

表3 回归模型方差分析Tab．3 The analysis of regression model variance

2．3．2 响应面结果与分析

三维响应面图见图2。

图2 生物基丁二酸纯化响应面图Fig．2 Response surface methodology of bio－based succinic acid purification

由图2可知，活性炭加量、脱色温度和脱色时间对生物基丁二酸纯度的影响显著，且活性炭加量与脱色时间交互作用明显，该模型预测的最高纯度为98．9%。优化的纯化条件为：活性炭加量3．3%、脱色温度72℃、脱色时间37min。

2．3．3 优化纯化条件验证实验

在优化纯化条件即活性炭加量3．3%、脱色温度72℃、脱色时间37min下，进行5批次的生物基丁二酸纯化实验，平均纯度达到98．44%，接近回归方程预测值。表明所建立模型可反映各因素对生物基丁二酸纯度的影响，纯化条件可行。

2．4 不同提取方法比较

表4归纳了不同提取方法得到的生物基丁二酸的收率和纯度。

表4 不同提取方法得到的生物基丁二酸的收率与纯度／%Tab．4 Yield and purity of bio－based succinic acid obtained by different extraction methods／%

由表4可知，与络合萃取法、钙盐法、酸结晶法比较，酯化法提取生物基丁二酸的效果较好。

2．5 生物基丁二酸的表征

以色谱纯丁二酸为标样，对生物基丁二酸进行红外表征，结果见图3。

图3 丁二酸标样（a）和生物基丁二酸（b）的红外光谱Fig．3 IR Spectra of succinic acid standard sample（a），bio－based succinic acid（b）

由图3可知：2 400～3 300cm－1处有宽吸收带，1 419cm－1处有较强吸收，说明存在－COOH；1 694 cm－1处为 C＝O伸缩振动吸收，1 207cm－1和1 310 cm－1处分别为C－O伸缩振动和O－H面内变形振动吸收，1 630～1 680cm－1处没有吸收，说明不存在C＝C键；生物基丁二酸与色谱纯丁二酸的吸收峰吻合，具有相同的基团，表明提取产物确为生物基丁二酸。

为进一步表征生物基丁二酸的晶体结构，对其进行X－射线衍射分析，结果见图4。

图4 丁二酸标样（a）和生物基丁二酸（b）的XRD图谱Fig．4 XRD Patterns of succinic acid standard sample（a），bio－based succinic acid（b）

由图4可知，与标样相比，生物基丁二酸在2θ为19．9°、26．0°和31．4°处具有相同的晶体特征峰。说明酯化法提取的生物基丁二酸与标样有相同的晶型。

2．6 生物基丁二酸的微观形貌

利用扫描电子显微镜观察生物基丁二酸的微观形貌，见图5。

图5 生物基丁二酸的扫描电子显微镜照片Fig．5 The SEM images of bio－based succinic acid

由图5可知，与标样相比，酯化法得到的生物基丁二酸晶体在微观形貌上不规则，晶体形状各异，可能是酯化过程中其它物质与丁二酸之间的相互作用力改变了生物基丁二酸晶体的外貌形状［10］。与未纯化生物基丁二酸相比，纯化后的生物基丁二酸晶形更不规则，可能是因为结晶温度导致生物基丁二酸的微观形貌发生了进一步的改变［17］。

3 结论

（1）80%乙醇中，丁二酸二钠和水合硫酸钠微溶、丁二酸溶解度较大，有利于丁二酸的分离纯化。

（2）正交实验优化的酯化条件为：丁二酸盐为丁二酸二钠、氢离子与丁二酸二钠的物质的量比为2．2∶1、反应时间为12h，在此条件下，生物基丁二酸收率为91．7%。Box－Behnken中心组合设计实验优化的纯化工艺为：活性炭加量3．3%、脱色温度72℃、脱色时间37min，在此条件下，生物基丁二酸纯度达到98．44%。

（3）通过红外光谱和X－射线衍射分析确证所提取的物质为生物基丁二酸，与丁二酸标样具有相同的晶体特征峰。通过扫描电子显微镜观察可知，提取条件对丁二酸的微观形貌有影响。

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