糖尿病大鼠不同阶段Ghrelin变化与胃排空关系的研究

尹红，张喜娟，严祥，陈明，刘纯

(1.自贡市第四人民医院消化内科，四川 自贡 643000；2.兰州大学第一附属医院干部病房，甘肃 兰州 710000；3.兰州大学第一附属医院核医学科，甘肃 兰州 710000)

·论著·

糖尿病大鼠不同阶段Ghrelin变化与胃排空关系的研究

尹红1，张喜娟2，严祥2，陈明3，刘纯3

(1.自贡市第四人民医院消化内科，四川 自贡 643000；2.兰州大学第一附属医院干部病房，甘肃 兰州 710000；3.兰州大学第一附属医院核医学科，甘肃 兰州 710000)

目的观察不同阶段糖尿病大鼠Ghrelin的变化情况与胃运动异常之间的联系，了解在糖尿病的不同阶段Ghrelin对胃排空的影响。方法66只Wistar大鼠随机分为2周糖尿病组(DM-2w)及对照组（NC-2w）、8周糖尿病组(DM-8w)及对照组(NC-8w)、20周糖尿病组(DM-20w)和对照病组(NC-20w)。高脂料喂养诱导胰岛素抵抗后以小剂量链脲佐菌素(STZ，30 mg/kg)腹腔注射，制作2型糖尿病大鼠模型。造模成功后第2周、第8周、第20周进行核素法胃排空测定胃半排时间、50 min胃内核素残留率；酶联免疫法测定血浆Ghrelin水平，免疫组化方法观察胃组织Ghrelin免疫阳性细胞密度。结果(1)DM-2w组半排时间为(22.99±2.53)min，与NC-2w组(48.76±22.06)min比较胃排空明显加快，差异有统计学意义(P＜0.01)。DM-8w组半排时间为(35.24±11.00)min，与NC-8w组(43.59±13.79)min比较差异无统计学意义(P＞0.05)。DM-20w组半排空时间为(84.02±27.54)min，与NC-20w组(47.79±13.22)min比较胃排空时间延长，差异有统计学意义(P＜0.01)。各对照组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。(2)DM-2w组大鼠血浆Ghrelin水平显著升高，与NC-2w组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。DM-8w组大鼠血浆Ghrelin水平与NC-8W组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。DM-20w组大鼠血浆Ghrelin水平与NC-20w组及DM-2w组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。各对照组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。(3)血浆Ghrelin水平与胃半排空时间呈负的直线相关。结论(1)糖尿病的不同阶段胃动力的变化有着不同的形式，在早期以胃动力加速为主；随着糖尿病病程的进展，胃排空逐渐减慢延迟。(2)在胃动力变化的过程中，血浆Ghrelin也呈现出与胃动力变化类似的变化趋势。(3)血浆Ghrelin水平与胃半排空时间呈负相关。

胃排空；Ghrelin；糖尿病大鼠

在糖尿病的不同阶段，胃动力异常具有不同的表现形式。胃动力障碍在糖尿病患者中发病率高达90%[1]。胃动力障碍在糖尿病早期常以胃排空加速为主；晚期由于各种因素的影响，常可见胃排空明显延迟，这与文献资料上Ghrelin在糖尿病中变化极为相似。Ghrelin是1999年Kojima等[2]发现的第一个生长激素促分泌剂受体的内源性配体，是一种重要的脑-肽和胃肠激素，在胃肠运动和消化液的分泌具有重要的生理意义。它在糖尿病早期升高，在糖尿病胃轻瘫患者中含量明显降低[34]。这种变化也许有助于解释糖尿病胃肠病变中的早期胃排加速与中晚期的胃排空延迟。我们通过观察糖尿病大鼠不同阶段Ghrelin的变化，探讨Ghrelin在糖尿病胃动力异常中所起的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF级雄性Wistar大鼠66只，体质量(200±20)g，购自甘肃中医学院SPF动物实验中心。

1.1.2 药品及主要试剂链脲佐菌素(Strepozotocin，STZ)，美国Sigma公司；99锝-亚锡喷替酸，上海欣科公司；Ghrelin试剂盒，美国ADL公司。

1.1.3 试验仪器多功能时间分辨荧光免疫分析系统，Wallacvictor2；Infinia VC Hawkeye4 SPECT-CT (4Slices)system全数字化双探头，美国GE公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立66只Wistar大鼠基础饲料适应性饲喂1周后随机分为2周糖尿病组(DM-2w)及对照组(NC-2w)、8周糖尿病组(DM-8w)及对照组(NC-8w)、20周糖尿病组(DM-20w)和对照组(NC-20w)，每组10只。由于糖尿病大鼠免疫力低易死亡，为保证实验顺利进行，DM-20w组增加6只大鼠，因此DM-20w组为16只大鼠。NC组继续饲喂基础饲料，6周后腹腔注射柠檬酸缓冲液，每只1 ml。DM组以高脂高糖饲料喂养6周，诱导胰岛素抵抗[5]。然后实验组经腹腔注射柠檬酸缓冲液配制的链脲佐菌素(STZ，30 mg/kg，pH 4.4)；给药72 h及1周后测定尾静脉取血测定血糖，持续高于16.7 mmol/L并稳定者为糖尿病大鼠。实验结束DM-2w组剩余9只，DM-8w组剩余8只，DM-20w组剩余11只；NC-2w、 NC-8w和NC-20w组各10只。基础饲料购自兰州大学实验动物中心；高脂高糖饲料由66.5%基础饲料、10%猪油、20%蔗糖、2.5%胆固醇、1%胆酸钠混合加工制作而成。实验过程中动物单笼喂养，自由摄食、饮水，不予降糖药物控制血糖。

1.2.2 胃排空功能测定所有动物在最后一次饲喂后禁食12 h，不禁水。采用核素标记半固体试餐单光子发射计算机断层照像仪(Single photon emission computer tomography，SPECT)显像技术测定胃半排空时间(Gastric emptying time，GET 1/2)与50 min胃内核素残留率(Retention rate，RR)。半固体试餐为放射性药物99锝-亚锡喷替酸(99mTc-Diethylenetriamine pentacetic acid，99mTc-DTPA)标记的面粉糊剂，体积为1 ml，由1 ml双蒸水与0.5 g标准粉配制而成[6]；放射性药物活度为3.7 MBq(0.1 mCi)。将大鼠置于特制的鼠板上，使大鼠体位固定，不能自由活动，同时将低能通用型准直器的探头视野中心置于大鼠腹部(窗宽20，矩阵128×128，放大倍数310)，以全胃作为感兴趣区，即刻采集其放射性记数并显像。将该计数作为初始计数，前20 min间隔5 min采集1次，后30 min间隔10 min采集1次，每帧采集时间为30 s，共计8帧，整个采集时间50 min。手工勾画胃轮廓，得出胃排空时间(GET)1/2和50 min胃内核素残留率。餐后50 min胃排空率=(1-胃内存留放射性核素量)×100%。

1.2.3 血浆Ghrelin含量测定1 ml静脉血加入预冷的乙二胺四乙酸(EDTA-2)1 mg、抑肽酶500 kIU/ml混匀，4℃，3 000 r/min离心10 min，取上清，-80℃贮存。酶联免疫法(ELISA)测定血浆Ghrelin肽的含量，各步骤严格按照说明书操作。试剂盒为美国ADL公司产品，Catalog No：BA1619。ELISA测定范围：200μg/ml，批内变异系数＜5%。检测步骤严格按照试剂盒的说明进行操作，所有试验在20℃～30℃室温进行。

1.3 统计学方法采用SPSS11.0统计软件进行数据处理。计量资料先进行正态检验和方差齐性检验，满足正态分布和方差齐性后组间用两样本t检验，组内用单因素方差分析，病理指标采用多组有序变量资料的秩和检验进行分析。计量数据间的相关关系采用Pearson线性相关分析，检验水准取α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体重各组大鼠初始体质量差异无统计学意义(P＞0.05)。造模前高脂高糖饲料喂养的糖尿病组大鼠体质量增长迅速，经STZ诱导为糖尿病模型20周后实验组大鼠体质量较成模前下降。各组大鼠体重比较见表1、图1。

表1 各组大鼠体重()

表1 各组大鼠体重()

注：与对照组比较：aP＜0.05；bP＜0.01。

组别NC-2w DM-2w NC-8w DM-8w NC-20w DM-20w只数10 9 10 8 10 11初始体重(g) 200±17.1 196±10.3 199±14.1 194±15.2 196±19.5 199±18.3造模时体重(g) 300±17.8 394±31.9b 319±21.3 396±19.5 302±18.9 403±17.2b实验结束时体重(g) 332±23.5 369±21.1a379±30.5 327±22.6 363±26.6 285±26.2b

图1 实验期间大鼠体重变化

2.2 各组大鼠血糖比较各组大鼠初始血糖差异无统计学意义(P＞0.05)。DM-2w、DM-8w、DM-20w大鼠在腹腔注射STZ 72 h后其随机血糖较正常对照组大鼠显著增高，差异有统计学意义(P＜0.01)。糖尿病各组造模血糖差异无统计学意义(P＞0.05)，对照组造模前后血糖差异无统计学意义(P＞0.05)。DM-20w组造模后72 h及实验结束时血糖较造模初期下降，差异无统计学意义(P＞0.05)。NC-20w实验结束时血糖较初始血糖有上升趋势，但前后差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 各种大鼠血糖比较(，mmol/L）

表2 各种大鼠血糖比较(，mmol/L）

注：与对照组比较，aP＜0.01。

组别NC-2w DM-2w NC-8w DM-8w NC-20w DM-20w只数10 9 10 8 10 11初始血糖5.19±0.49 5.50±0.42 5.17±0.27 5.27±0.35 5.00±0.49 5.12±0.49造模后72 h血糖5.65±0.24 27.07±6.14a5.27±0.68 24.91±3.73a5.47±0.55 27.32±7.00a实验结束时血糖5.24±0.30 26.94±5.73a5.77±0.29 26.40±3.27a6.25±0.56 22.34±2.75a

2.3 胃半排时间和50 min胃内核素残留率的比较DM-2w组半排时间为(22.99±2.53)min，与NC-2w组(48.76±22.06)min比较胃排空明显加快，差异有统计学意义(P＜0.01)。DM-8w组半排时间为(35.24±11.00)min，与NC-8w组(43.59±13.79)min比较差异无统计学意义(P＞0.05)。DM-20w组半排空时间为(84.02±27.54)min，与NC-20w组(47.79± 13.22)min比较胃排空时间延长，差异有统计学意义(P＜0.01)。各对照组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。DM-2w组的50 min胃内核素残留率较NC-2w组明显减少(P＜0.01)。DM-8w组的50 min胃内核素残留率较NC-8w组减少(P＞0.05)。DM-20w组50 min残留率较NC-20w组明显增加(P＜0.01)。糖尿病各组50 min胃内残留率之间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，对照组各时间点差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

表3 各种大鼠胃排空时间50min胃内核素残留率()

表3 各种大鼠胃排空时间50min胃内核素残留率()

注：与对照组比较aP＜0.05；bP＜0.01。与DM-20w组比较：aP＜0.05；bP＜0.01。

组别NC-2w DM-2w NC-8w DM-8w NC-20w DM-20w只数10 9 10 8 10 11 GET1/2(min) 48.76±22.06 22.99±2.53bd43.59±13.79 35.24±11.00c47.79±13.22 84.02±27.54a50 min胃内核素残留率(%) 45.40±18.97 9.44±5.73bd41.33±16.34 31.50±15.62c46.50±19.00 62.36±19.27a

2.4 胃排空曲线DM-2w组各时间点上胃内残留率均低于NC-2w组，胃排空明显加快；DM-8w组各时间点上胃内残留率与NC-8w组相似；DM-20w组各时间点上胃内残留率均高于NC-20w组，胃排空延迟。对照组在各时间点的胃内残留率差异无统计学意义(图2)。

图2 各组大鼠胃排空曲线

2.5 血浆Ghrelin含量比较DM-2w组大鼠血浆Ghrelin水平显著升高，与NC-2w组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。DM-8w组大鼠血浆Ghrelin水平与NC-8W组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。DM-20w组大鼠血浆Ghrelin水平与NC-20w组及DM-2w组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。各对照组之间差异无统计学意义(P＞0.05)(图3)。

图3 各组血浆Ghrelin含量比较

2.6 血浆Ghrelin含量与胃半排空时间相关性分析Pearson相关系数r=-0.449，P=0.007，按0.01水准，可以认为血浆Ghrelin含量与胃半排空时间呈负的直线相关(图4)。

图4 血浆Ghrelin含量与胃半排空时间相关性分析

3 讨论

高脂饲料喂养加小剂量STZ注射诱导的糖尿病模型是通过高脂肪饲料喂养以诱导大鼠产生肥胖和胰岛素抵抗；再以小剂量链脲佐菌素腹腔注射，利用STZ选择性作用于大鼠的胰腺，使胰腺的β细胞产生不可逆的损伤，引起胰岛素分泌相对不足，产生高血糖，与临床上2型糖尿病的发病过程类似，并具有典型的2型糖尿病的代谢特征，是一种比较理想的2型糖尿病模型[7]。目前国外常采用的2型糖尿病模型，如ob/ob小鼠和OL ETF大鼠[8]，遗传因素在发病机制中起着主导作用，价格昂贵，限制了它在国内的使用。高脂饲料加小剂量STZ所制作的糖尿病大鼠模型动物具有来源充分、价格便宜、造模方法简单的特点，目前是在研究2型糖尿病的病理生理实验研究及治疗糖尿病药物的实验使用最为广泛的糖尿病大鼠模型。

在糖尿病的病程中，合并胃动力异常在临床上很常见，多表现为上腹胀、早饱、嗳气、恶心、呕吐等。据统计，50%～60%的1型糖尿病患者固体食物和/或营养性液体食物的胃排空时间显著延迟[9]；但是，在2型糖尿病、非胰岛素依赖型糖尿病和没有自主神经病变的1型糖尿病的早期患者中，常可观察到胃排空加速的情况[10-11]。在STZ诱导的早期糖尿病大鼠模型和BB的自发性糖尿病大鼠模型中胃排空加速也有报道[3]。当前多集中在对糖尿病并发胃轻瘫上的研究上，对导致早期糖尿病胃动力的加速机制研究还没有进行深入的探讨，更缺乏以一个整体的观念去关注糖尿病疾病发展过程中的胃动力变化。

糖尿病患者胃动力异常发生的机制尚不十分明确，推测与消化系统的神经病变、血管病变、胃平滑肌病变及高血糖对胃起搏点的影响有关。但这都不足以解释在糖尿病的不同阶段，糖尿病的胃动力障碍从早期的胃排空加速到晚期的排空延迟这一改变。Ghrelin的出现为我们研究这一问题提供了一个新的思路。Ghrelin是在大鼠胃中发现的内源性生长激素的一个配体。它由胃的X/A样细胞产生，翻译加工后释放入血，第三位丝氨酸上的辛酰基是它的主要的活性基团。Ghrelin具有多种生理作用，通过下丘脑刺激食欲、增加胃酸分泌、促进胃肠蠕动[12]；加速大鼠、人和小鼠对固体及营养性液体的排空。国外最新的研究发现在糖尿病早期血浆Ghrelin水平明显增高，通过增加幽门与十二指肠的协调性运动加速了胃排空。在晚期糖尿病及糖尿病胃轻瘫患者中Ghrelin含量明显降低[4]。这种变化也许有助于解释糖尿病胃肠病变中的早期胃排加速与中晚期的胃排空延迟这一现象。

胃对固体和液体的排空有着不同的机制。对液体的排空来自于胃和十二指肠之间的压力梯度；固体的排空由胃窦、幽门和十二指肠的协调性运动所调节，窦与幽门的协调性运动在大鼠对固体的排空也起着重要的作用。Ghrelin加速胃的排空机制，也主要是刺激胃窦、幽门和十二指肠的协调性运动。为了证实Ghrelin参与了糖尿病早期胃排空加速和晚期胃排空延迟与胃轻瘫的发展过程这个假设，我们通过高脂饮食加小剂量的STZ腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型，测定糖尿病大鼠不同阶段的血浆Ghrelin水平；并利用核素胃排空法测定的胃排空时间、50 min胃内核素残留率。放射性核素胃排空检查能确切检查液体和固体从胃排空的速度，具有非侵入性、不干扰正常生理、可定量、重复性好等特点，是检测胃排空的“金标准”。固体食物排空是检测胃功能不全的早期灵敏指标，但由于方法复杂，使其临床应用受到了一定限制，有研究表明半固体试餐能较好地反映胃的排空情况[13]。本实验采用核素法测定糖尿病大鼠的半固体胃排空，采集的图像清晰，使动物实验中胃排空功能的测定更接近人类的胃排空方法。

实验结果显示，Ghrelin参与了从2周糖尿病大鼠胃排空加速到20周胃排空减慢的发病过程。根据文献，糖尿病的自主神经病变出现在注射STZ后6～8周[14]。由于排除了自主神经和血管病变的影响，我们推测，糖尿病2周时，大鼠胃排空的加速主要是由于升高的血浆Ghrelin水平所引起。现糖尿病后期胃轻瘫的发病机制尚不完全清楚，普遍认为主要与神经病变、胃肠激素异常、高血糖、胃微血管和平滑肌病变、Cajal间质细胞缺失、幽门螺杆菌感染等有关[15]，降低的血浆Ghrelin水平可能只是导致胃动力障碍的一个方面。

胰岛素是影响血浆Ghrelin水平的重要因素，使用胰岛素灌流离体的鼠胃，显示胃内的Ghrelin分泌受到抑制，提示胰岛素对Ghrelin水平具有调节作用[16]。高血浆胰岛素钳夹实验研究显示，在人和大鼠中胰岛素对Ghrelin的分泌产生抑制作用[17]，但是它不能解释后期的血浆Ghrelin水平降低与胰岛素的关系，或许是由于在糖尿病后期自主神经病变和血管病变等多种因素亦会对胃排空产生一定的影响，也有可能与不同阶段胰岛素对胃运动功能的影响不尽相同所致。

糖尿病后期，胃内分泌Ghrelin的免疫活性细胞数量减少是引起血浆Ghrelin水平的下降的主要原因。此外，Ghrelin分泌受到来自于自主神经的迷走神经影响。而在糖尿病患者中，可以观察到食管胃迷走神经常出现形态学的异常，如神经轴突脱髓鞘、轴索萎缩等变化[18]。在用STZ制作的糖尿病大鼠模型上也发现了神经树突肿胀，肾上腺素能、胆碱能神经结构异常[19]。因此，自主神经病变亦应该是导致血浆Ghrelin降低的另一原因。

就目前研究结果来看，Ghrelin参与了糖尿病胃动力异常的发病过程，但不是唯一因素。Ghrelin表达与分泌的调控机制比较复杂，在许多重要的问题上缺乏一致性的意见，而机体是统一的整体，糖尿病时全身代谢紊乱，影响血浆Ghrelin水平的因素较多。我们尚不清楚引起Ghrelin水平在糖尿病早期升高和后期降低这一变化的真正原因，也不清楚早期升高的Ghrelin水平能否被胰岛素的治疗所逆转。对Ghrelin的深入研究将有助于更好地探讨糖尿病胃动力障碍的机制。

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Relationship between ghrelin and gastric emptying in diabetic rats at different stages.

YIN Hong1,ZHANG Xi-juan2,YAN Xiang2,CHEN Ming3,LIU Chun3.1.Department of Gastroenterology,the Fourth People's Hospital of Zigong,Zigong 643000,Sichuan,CHINA;2.VIP Department,the First Affiliated Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 710000,Gansu,CHINA；3.Department of Nuclear Medicine,the First Affiliated Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 710000,Gansu,CHINA

ObjectiveTo investigate the relationship between ghrelin and gastric emptying in diabetic rats at different stages.MethodsSixty-six Wistar rats were randomly divided into six groups∶2 week diabetic group (DM-2w group)and 2-week control group(NC-2w group),8-week diabetic group(DM-8w group)and 8-week control group(NC-8w group),20-weeks diabetic group(DM-20w group)and 20-week control group(NC-20w group). Type 2 diabetes model was induced in rats by intraperitoneal injection of a low dose of streptozotocin plus long-term high fat and high caloric laboratory chow.The gastric emptying half time(GET1/2)and 50 min residual rate were measured by single photon emission computed tomography(SPECT),the level of ghrelin in plasma was detected by Enzyme-linked immunosorbent test(ELISA)and ghrelin immunoreactive positive cells were observed in gastric tissue at 2 weeks,8 weeks or 20 weeks,respectively before the rats were sacrificed.Those data were compared between the control and model groups.Results(1)The GET1/2 in DM-2w group was significantly faster than that in NC-2w group[(22.99±2.53)min vs(48.76±22.06)min,P＜0.01].There was no difference between DM-8w group and NC-8w group(P＞0.05).The GET1/2 in DM-20w group was significantly lower than that in NC-20w group[(84.02±27.54)min vs(47.79±13.22)min,P＜0.01].(2)The increased size of plasma ghrelin level in DM-2w group was significantly higher than that in DM-2w group(P＜0.05).There were no differences between DM-8w group and NC-8W group(P＞0.05). There were significant differences between DM-20w group and NC-20w group and DM-2w group(P＞0.05).(3)There was a negative correlation between plasma ghrelin level and gastric half-emptying time.Conclusion(1)The changes of gastric motility varied at different stages of diabetes.In early stage,it presented accelerates gastric motility. With the progression of diabetes,gastric emptying gradually slowed down.(2)With the changes of gastric motility, ghrelin in plasma showed a similar trending with gastric motility.(3)There was a negative correlation between plasma ghrelin level and gastric half-emptying time.

Gastric emptying;Ghrelin;Diabetic rats

R-332

A

1003—6350（2014）19—2809—05

2014-04-15)

甘肃省医药卫生科研项目（编号：GSWST09-04）

严祥。E-mail：Yanxiang528@sohu.com

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2014.19.1108