蒙药玉簪花总多糖提取工艺优选与含量测定

王娜娜，薛培凤，耿 婕，魏 慧，李凤英，张冬艳

（内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010110）

蒙药玉簪花是百合科植物玉簪 Hosta plantaginea（Lam．）Aschers．的干燥花，又名内消花、白鹤花、白玉簪等，是蒙医专用、常用药材之一，具有悠久的蒙医临床用药历史和确切的疗效。蒙药典籍《蒙药正典》中已有记载。《中华本草》（蒙药卷）记载其性寒，味涩、苦，效软、柔、稀，具有清热、解毒、止咳、利咽喉之功效，主治咽喉肿痛、音哑、肺热、毒热。但有关玉簪花及其制品中多糖的检测方法及含量的影响因素，国内外尚无文献报道。本试验采用单因素及正交试验对玉簪花总多糖提取工艺进行了优选，并建立了测定玉簪花多糖含量的方法，为玉簪花的进一步开发利用及其多糖的生物活性研究奠定基础[1]。

1 仪器与试药

AL204型电子天平（梅特勒－托利多仪器上海有限公司）；TU－1901型双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；BFX5－320型低速自动平衡离心机（白洋离心机厂）；IKARV10型旋转蒸发仪（德国）；HH－S型数显恒温油浴锅（金坛市医疗仪器厂）；BGZ－146型电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司）。玉簪花药材于2013年2月购自内蒙古药材公司，经内蒙古医科大学乔俊缠教授鉴定为百合科植物玉簪H．plantaginea的花；葡萄糖(天津市福晨化学试剂厂)，无水乙醇(天津市风船化学试剂科技有限公司)，苯酚（天津永晟精细化工有限公司），石油醚(天津市风船化学试剂科技有限公司)，浓硫酸（天津大茂化学试剂厂），以上试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 提取工艺单因素考察[2]

2．1．1 提取温度

将玉簪花药材粉碎过40目筛，称取1．0 g干燥的玉簪花药材粉末5份，精密称定，分别以石油醚30 mL回流脱脂3 h，挥去石油醚。脱脂后的药材分别在室温条件下以水浸泡2 h，料液比1 ∶20，在不同温度（60，70，80，90，100 ℃）下提取 2 h，提取次数为1次，过滤去渣，向提取液中加无水乙醇至含醇体积为80%，沉淀多糖，放入冰箱，静置过夜，离心。将沉淀的多糖溶于蒸馏水，采用苯酚硫酸法测定其含量。在上述条件下，每份平行操作2次，结果取2次测定的平均值，考察提取温度对总多糖得率的影响[3]。结果见表1。

2．1．2 提取时间

方法同 2．1．1 项，提取温度为 90 ℃ ，在不同提取时间（1，2，3，4，5 h）内各提取1次，测定其含量，考察提取时间对总多糖得率的影响[4]。结果见表1。

2．1．3 料液比

方法同 2．1．1项，提取时间为 3 h，提取温度为 90℃，在不同料液比（1 ∶10，1 ∶20，1 ∶30，1 ∶40，1 ∶50）条件下各提取 1 次，测定其含量，考察料液比对总多糖得率的影响。结果见表1。

2．1．4 提取次数[5]

方法同 2．1．1项，按料液比 1∶20，提取温度为 90℃，提取时间为3 h，在不同提取次数的条件下，测定其含量，考察提取次数对总多糖得率的影响。结果见表1。

2．2 提取工艺正交试验[6－7]

在2．1项下单因素试验基础上，结合文献，以料液比（因素A）、提取时间（因素 B）、提取温度（因素 C）、提取次数（因素 D）为最终因素进行考察，每个因素3水平，进行 L9(34)4因素3水平正交试验，以玉簪花总多糖得率为考察指标。因素水平表见表2(正交试验重复做2次，结果取2次测定的平均值)。正交试验结果及方差分析结果见表3和表4。可见，因素D对提取工艺有显著性影响（P＜0．05），各因素的影响大小顺序依次为 D＞A＞B＞C，即提取次数＞料液比＞提取时间＞提取温度。结合单因素试验及正交试验结果，得出各因素的最佳水平依次为A3B3C3D2。根据生产实际考虑，B选择 B2。综合选择，最佳提取工艺条件为A3B2C1D2，即料液比 1∶30，提取时间 3 h，提取温度 80℃，提取次数3次。

表1 玉簪花多糖提取工艺单因素考察结果

表2 提取工艺正交试验因素水平表

表3 正交试验结果

表4 正交试验方差分析结果

2．3 含量测定及方法学考察[8]

2．3．1 对照品溶液制备

称取105℃干燥至恒重的葡萄糖10．01 mg，精密称定，加水溶解并定容于100 mL容量瓶中，摇匀，即得葡萄糖对照品贮备液(0．1 g ／L)[9]。

2．3．2 测定波长选择[10]

采用苯酚－硫酸显色法，分别精密吸取对照品及供试品溶液1 mL，加入5%苯酚溶液 1 mL，充分摇匀，迅速贴壁加入浓硫酸5 mL，静置 30 min。同法制得空白对照溶液，在紫外分光光度计200～600 nm波长范围扫描，作图。确定本试验玉簪花药材中总多糖的测定波长为488 nm。

2．3．3 方法学考察

线性关系考察：精密量取葡萄糖对照品贮备液 0．2，0．3，0．4，0．6，0．7，0．8 mL，置 6 个干燥试管中，分别加水补至 1．0 mL，在488 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标、含量为横坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y＝8．903 6 X＋0．041 7，r＝0．999 4（n＝6）。结果表明，葡萄糖溶液质量浓度在 0．02～0．08 g／L 范围内与吸光度呈良好的线性关系。

精密度试验：取同一对照品溶液，分别依法测定6次。结果吸光度的 RSD＝0．17%（n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一样品6份，依法制备供试品溶液并测定含量。结果的 RSD＝2．96%（n＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，于制备后6 d内每隔1 h测定 1次吸光值，共测定 6次。结果的 RSD＝1．21%（n＝6），表明供试品溶液在6 h内稳定性良好。

加样回收试验：称取6份玉簪花药材粉末各 0．5 g，精密称定，脱脂提取、沉淀多糖后，定容于50 mL容量瓶中，吸取1 mL，置25 mL容量瓶中，加入已知质量浓度的葡萄糖对照品溶液，用蒸馏水定容。按标准曲线项下苯酚－硫酸法分别测定吸光度，根据葡萄糖的检出量计算回收率。结果葡萄糖平均回收率为98．26% ，RSD ＝2．05% （n＝6）。

2．3．4 样品含量测定

准确称量玉簪花粉末1．0 g，对原料脱脂后，室温条件下浸泡2 h，根据正交试验最佳提取条件（即料液比为1∶30，80℃提取3次，每次3 h）提取，合并提取液，减压浓缩，向浓缩液中加无水乙醇至含醇80%，沉淀多糖，放入冰箱(4℃)，静置过夜；离心分离，沉淀多糖全部溶于蒸馏水，定容，即得供试品溶液。采用苯酚－硫酸法，测定其含量，结果为3．65%。

表5 最佳提取工艺验证试验

2．4 最佳提取工艺验证

称取玉簪花粉末20 g，以正交试验优选的最佳提取工艺参数进行试验验证，应用优化后工艺条件进行提取，按拟定含量测定方法依次测定。结果见表5。可见，多糖得率平均值比单因素试验的得率高，且 3次得率基本接近，说明用优化后的工艺条件重复性好。

3 讨论

多糖是一类天然大分子化合物，由10个以上至成千个单糖脱水形成的天然高分子聚合物，是构成生命的分子基础之一。多糖易溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂，最常见的提取方法是水提醇沉，沉淀干燥后即为粗多糖。大量的药理及临床研究表明，多糖具有抗癌、增强免疫力等作用，对于预防和治疗包括癌症在内的多种疾病都具有巨大的潜力，因此多糖的研究目前已成为关注的焦点。百合科植物多糖的研究在近年才逐渐开展起来，提取条件已比较清楚，可考虑进一步放大处理。但对其化学结构的研究仍然非常有限，大多数已报道的百合科植物多糖的结构信息不够详尽，高级结构的研究还是空白，故需作进一步的结构分析。有关其药理作用方面的研究较多，但没有涉及进一步的作用机理及功能结构。从应用研究的角度来看，百合科植物多糖具有很多药理作用，极有潜力开发为新型的药物和保健品。百合科植物种类很多，分布也很广，资源极其丰富，多糖含量高，因此对百合科植物多糖进行广泛深入地研究，具有巨大的开发和应用价值。

本试验采取单因素试验及4因素3水平正交试验方案对玉簪花多糖的提取条件进行了优化。由正交试验结果分析可知，提取次数是最主要的影响因素，其次是料液比，提取时间及提取温度影响不显著。工艺放大试验研究表明，该工艺条件简单、稳定可行，为有效开发利用玉簪花多糖奠定了基础。

采用苯酚－硫酸法测定玉簪花多糖的含量，通过石油醚脱脂，挥干后水提，再以乙醇醇沉分离多糖成分。方法学考察结果表明，采用该法测定玉簪花多糖的含量，方法简单、可靠、重复性好、显色稳定。

综上所述，玉簪花多糖尚待进一步研究，通过基础的最佳提取方法确定和含量测定，为进一步研究多糖的纯化方法及药理活性奠定了基础。讯作者，(电话)0471 －6653146（电子信箱）xpfdc＠ vip．sina．com。

参考文献：

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[2]黎晶晶，徐格非．苯酚－硫酸法测定灵芝多糖含量的研究[J]．杭州化工，2008，38(1):23 －26．

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[5]杨翠玲，郭爱华，高 山．浑源黄芪中黄芪多糖提取条件的优选[J]．世界中西医结合杂志，2011，6(1):60－62．

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