高效液相色谱法测定尿素乳膏中尿素含量

张 毅 ，黄 静 ，郭盈杉

(1．河北省食品药品检验院，河北 石家庄 050011； 2．河北省石家庄市药品不良反应监测中心，河北 石家庄 050031)

尿素乳膏为皮肤外用药，曾用名治裂膏，主要成分为尿素，化学名为碳酰二胺，主要用于治疗鱼鳞病、手足皲裂、皲裂性湿疹、老年皮肤瘙痒及掌趾角化症[1]。该品种质量标准收载于2010年版《中国药典（二部）》[2]，含量测定方法采用显色后紫外－可见分光光度法。也有文献报道，采用紫外－可见分光光度法测定尿素乳膏医院制剂中尿素的含量[3]。但该方法准确度不高，测定结果受显色剂影响较大，使用不同供应商提供的对二甲氨基苯甲醛配制显色剂，空白基质的吸光度有很大差别；测定时对供试品溶液放置时间的要求高，测定结果重现性差。而采用凯式定氮法测定尿素的含量[4]，操作烦琐，专属性差。为此，笔者拟建立专属性强、灵敏度高、重复性好、操作简便的高效液相色谱（HPLC）法，用于测定尿素乳膏的含量。

提高微电子技术是加强综合国力的重要手段。未来的科技大都离不开微电子技术，就像现在的生活也离不开微电子技术一样，所以发展微电子技术是当前科学界的主流。我们应当秉持着坚持不懈的精神，继续探索研发微电子技术，不断缩小我国与世界上发达国家的差距，最终实现我国和世界先进的微电子技术完美接轨，让我国走在世界的前列。

1 仪器与试药

LC2010CHT型高效液相色谱仪（日本岛津），包括紫外检测器、自动进样器；TU－1901型双光束紫外可见分光光度计（普析通用）。尿素对照品（USP对照品）；尿素乳膏（含10%尿素，由各生产企业提供）；空白辅料（按最大处方量自行配置）；对二甲氨基苯甲醛（北京化工厂，批号为920404）；乙腈、甲醇为色谱纯，水为去离子水，其他试剂均为分析纯。

夜色被时光的流水漂洗净了，风影又开始敲木鱼了。木鱼的眼睛醒着，一记一记的声音十分清脆。他正敲着，一根毛辣子虫掉了下来，不偏不倚地落在他的后颈上，顿感痒痒起来，他便用手朝后颈挠了一下，不料越挠越痒，皮肤都红肿了一大片。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱：月旭 Ultimate XB －NH2柱（200 mm ×4．6 mm，5 μm）；流动相：乙腈－甲醇－10%磷酸调 pH至3．6的水溶液（90∶7∶3）；检测波长：200 nm；柱温：30 ℃；流速：0．8 mL ／min；进样量：20 μL。

2．2 溶液制备

取样品适量（约相当于100 mg尿素），置100 mL容量瓶中，加流动相适量，水浴加热使尿素溶解，放冷至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀，置冰浴中冷却，滤过，滤液为供试品溶液。按处方量称取空白基质适量，同法制备阴性对照品溶液。称取尿素对照品10 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加流动相振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2．3 方法学考察

重复性试验：取批号为100704的样品，依法制备6份供试品溶液，精密量取20 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算含量。结果的 RSD为0．48%（n＝6）。

图1 高效液相色谱图

作为平衡所涉不同利益的有用工具，在投资条约中列入文化例外或冲突条款，在实践中已有先例。例如，2005年5月28日，文莱、智利、新西兰、新加坡四国签订了《跨太平洋战略经济伙伴关系协议》(以下简称TPSEP)，建立自由贸易区，成员之间彼此承诺在货物贸易、服务贸易、知识产权以及投资等领域相互给予优惠并加强合作。TPSEP认识到有必要促进旨在保护有关国家文化遗产的文化政策，该协议中规定了针对文化方面的一般例外的情况，包括有形财产(考古和历史遗址)及其无形财产(创造性艺术)，目的在于保护具有历史或考古价值的物品或特定地点。

线性关系考察：称取尿素对照品约100 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取 0．1，0．5，1．0，1．5，2．0 mL，分别置 10 mL 容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。分别精密量取20 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以进样量(μg，X）为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y＝531 678 X－430 097，r＝0．999 5（n＝5）。结果表明，尿素进样量在2～40 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

在野外作业一天，实在太疲劳了，再加上一天只吃了一顿冷饭，个个都渴望吃顿可口的饭菜，洗个澡，然后美美地睡一觉。可是工地上，质量检查小组这时还在认真地逐段检查。他们突然发现，由于工序衔接不好，有一处防腐接头没有进行胶带缠绕就下沟埋土了，必须挖土返工。

精密度试验：称取尿素对照品约10 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取20 μL，连续进样6次，记录色谱图，测定尿素峰面积。结果的 RSD为0．42%（n＝6）。

稳定性试验：称取尿素对照品约10 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度并摇匀，室温分别放置1，2，4，6，8 h，精密量取20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果尿素峰面积平均值为 1 138 225，RSD 为 0．78%（n＝5）。

专属性试验：分别吸取 2．2项下 3种溶液各 20 μL，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图，见图1。可见，辅料不干扰主成分尿素的含量测定。

通过合理设置办公辅助区，能够缓解医患人员的工作压力，空间使用率较高。医院生殖医学中心中的办公辅助区主要包括值班室、办公室、计算机、休息室与卫生间等，设计人员可以根据其他功能区的设置情况，将办公辅助区与功能区进行合理连接。

10月19日，，该项目总投入为170亿元，计划于2020年建成投产，规划年产能30万辆。上汽大众新能源工厂占地面积40.56万m2，是大众汽车全球首个专门生产MEB平台纯电动车型工厂。新工厂将结合工业4.0的理念，采用最新的生产和自动化技术，大幅提升效率和劳动生产率。在自动化方面，新工厂将采用超过1 400多台工业机器人，其中车身车间拥有约1 000台机器人。

表1 尿素回收率试验结果（n＝9）

2．4 样品含量测定

共收集样品128批，涉及生产企业10家，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件，测定含量，并与现行标准2010年版《中国药典（二部）》中方法比较。选取批数较多的5家生产企业各3批产品列出检验结果，见表2；120批样品数据统计分析见表3。结果表明，HPLC法与药典方法的含量测定结果有显著性差异。

表2 HPLC法与药典方法样品含量测定结果比较（标示量的%）

表3 样品含量测定结果成对双样本 t－检验（a＝0．05）

项目平均值方差观测值泊松相关系数假设平均差df t Stat P(T＜＝t)单尾t单尾临界P(T＜＝t)双尾t双尾临界药典方法0．974 05 0．001 566 703 120 0．727 277 157 0 119 7．628 515 208 3．230 31E －12 1．657 759 285 6．460 62E －12 1．980 099 853 HPLC法0．955 117 0．000 768 120

3 讨论

以流动相作溶剂，在200～400 nm波长范围内测定了尿素对照品的紫外光谱图。结果尿素在196 nm波长处有最大吸收，因此选择200 nm为检测波长。

流动相的选择试验中，流动相A参照第33版美国药典中C13尿素原料含量测定方法的乙腈－甲醇－水（89∶10∶1），尿素峰形不对称，拖尾严重；流动相B为乙腈－甲醇－0．01 moL／L磷酸二氢铵溶液（89∶10∶1），尿素峰形有所改善，但仍有拖尾现象；流动相 C为乙腈 －甲醇 －10%磷酸调 pH至 3．6的 0．01 moL／L磷酸二氢铵溶液（89∶10∶1），尿素峰形对称，分离度良好，保留时间适中；流动相 D为乙腈 －甲醇 －10%磷酸调 pH至 3．6的水溶液（90∶7∶3），尿素峰形对称，分离度良好，保留时间适中。考虑到盐在大量有机溶剂中容易析出，选择流动相D进行试验。

流动相pH对尿素的保留时间、峰形影响较大。随着pH减小，主峰保留时间变短，峰形改善，分离度增加；但pH太低会影响色谱柱寿命，当pH＝3．6时，保留时间适当，峰形对称，分离度能达到要求。

溶剂的选择时，曾以乙醇和流动相作为溶剂分别进行试验，尿素在这2种溶剂中的溶解性都比较好。考虑到尿素的检测波长为200 nm，为末端吸收，且乙醇在末端有较大吸收，而流动相90%为乙腈，短波长溶剂吸收干扰小，因此选择流动相作为溶剂。

最低检测限确定：称取尿素对照品约10 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。吸取上述溶液适量，用流动相逐级稀释，依法进样。按3倍信噪比计算，尿素的最低检测限为 0．04 μg。

回收率试验：称取空白辅料约900 mg，共9份，分别置100 mL容量瓶中，分别加入尿素对照品约80，100，120 mg各3份，加流动相，按供试品溶液制备方法处理，精密量取20 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，计算回收率。结果见表1。

柱温对尿素的峰形、保留时间影响不大，但考虑到环境温度的变化可能造成的影响，故选择柱温为30℃。

本试验结果显示，HPLC法与现行标准2010年版《中国药典（二部）》中紫外法的含量测定结果有显著性差异，前者明显偏低，说明紫外法的含量测定结果受到了辅料的干扰，不能准确反映药品的实际质量，修订后的含量测定方法更科学、有效和可控。

参考文献：

[1]林慧萍，邹慧龙，梁晓美．4种医院制剂稳定性考察[J]．中国药业，2011，20（2）：51 － 52．

根据形势任务的需要，结合辖区地理位置和气候条件，密切关注辖区社会动态，按照“组织健全，训练有素，规模适当，反应迅速”的要求，建立民兵应急队伍，提升应急分队“平时服务、急时应急、战时应战”的能力。针对“人员分散集中难、外出务工在位少、岗位职责协调难”等现实问题，按照“专业对口、因地制宜、就地取材、就近支援”的原则，及时调整优化结构，确保配齐建强应急队伍。

[2]国家药典委员会．中华人民共和国药典（二部）[M]．北京：化学工业出版社，2010：379．

[3]刘 炜，孙 颖，曾蔚欣，紫外分光光度法测定尿素乳膏中尿素的含量[J]．天津药学，2011，23（6）：20 －21．

[4]GB／T 2441．1－2008，尿素的测定方法第一部分：总氮含量[S]．