液相色谱－串联质谱联用法测定心脑欣片中甜菜碱含量

赵 勇 ，王 艳 ，丁 野 ，郑金凤 ，李文莉

（1．湖南省食品药品检验研究院，湖南 长沙 410001； 2．湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208）

心脑欣片由红景天、枸杞子和沙棘鲜浆3味药材组方，具有益气养阴、活血化瘀之功效，用于气阴不足、瘀血阻滞引起的头晕、头痛、心悸、气喘、乏力，以及缺氧引起的红细胞增多症见上述证候者。其现行质量标准（国家食品药品监督管理局标准YBZ02242009）中无枸杞子含量测定项。枸杞子作为方中臣药，所含甜菜碱是枸杞子中主要生物碱之一，能调节体内渗透压，促进脂肪代谢和蛋白质合成，是体内高效的甲基供体。2010年版《中国药典（一部）》收载了枸杞子生品中甜菜碱含量测定的薄层扫描法[1]，但该法操作复杂、重复性差、误差大。文献[2－3]报道，采用高效液相色谱（HPLC）法在低波长或将甜菜碱衍生化后进行含量测定[2－3]，但前者灵敏度低、噪音大，而后者烦琐且反应不完全，测量结果有误差。本试验中建立了测定心脑欣片中甜菜碱含量的液－质联用法，方法简便、快速、灵敏度高、重复性好、实用性强，为进一步控制该药品的质量提供了技术支撑。

1 仪器与试药

Xevo TQ－S型液相色谱－串联质谱联用仪（美国Waters公司）；CG－300型超声波清洗仪(300 W，25 kHz)。甜菜碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号为 110894－200503，供含量测定用）；心脑欣片（国内某企业提供）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果[4－8]

2．1 色谱及质谱条件

色谱柱：Venusil HILIC 柱(100 mm ×2．1 mm，3 μm）；流动相：乙腈 － 水(80 ∶20)；流速：0．3 mL ／min；柱温：35 ℃；进样量：3 μL。离子源：电喷雾离子源（ESI）；离子化模式：正离子模式（positive）；多反应监测（MRM）；源电压4 kV；毛细管温度：400℃；锥孔电压：35 V；鞘气流速：800 L ／h；以 118．20→57．92 和 118．20→59．00为定量离子对，碰撞能量25 V。

2．2 溶液制备

精密称取甜菜碱对照品11．10 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL置100 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL置50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。取质量差异项下的本品，除去包衣，精密称定，研细，取约0．2 g，精密称定，置 100 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声处理30 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取1 mL置100 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按处方称取除枸杞子外的其他药材，按样品制备工艺制成缺枸杞子的阴性样品，同供试品溶液制备方法制成缺枸杞子的阴性对照品溶液。

2．3 方法学考察

阴性干扰试验：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各3 μL，依法测定，记录色谱图。供试品溶液色谱图中，在与对照品溶液色谱主峰保留时间的相应位置有相一致的色谱峰，缺枸杞子的阴性对照品溶液色谱则无此峰，表明阴性对照无干扰（图1）。

图1 甜菜碱多反应监测（MRM）图

线性关系考察：分别精密吸取甜菜碱质量浓度为4．44，17．76，53．28，88．80，142．08，177．6 ng ／mL 的对照品溶液各 3 μL，依法测定，以峰面积积分值为纵坐标、对照品质量浓度（ng／mL）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y＝13 605 X－25 320，r＝0．999 9（n＝6）。结果表明，甜菜碱进样质量浓度在 4．44～177．6 ng／mL范围内与峰面积积分值线性关系良好。

仪器检出限确定：精密吸取质量浓度为4．44 ng／mL的对照品溶液3 μL，依法测定。结果信噪比为 74．2时，折算仪器检出限为 0．2 ng ／mL。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液3 μL，连续进样6次。结果甜菜碱峰面积的 RSD为1．5%（n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批样品（批号110901），依法制备6份供试品溶液并测定含量。结果平均含量为 2．245 5 mg／g，RSD为1．3%（n＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于配制后 0，3，7，10，15，24 h时精密吸取 3 μL，依法测定。结果甜菜碱峰面积的 RSD为1．2%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收试验：称取已知含量的同一批(批号为110901)样品(含甜菜碱 2．245 5 mg／g）0．1 g，精密称定，共 6 份，分别置 100 mL容量瓶中，分别精密加入对照品溶液（0．222 g／L）1 mL，照供试品溶液制备方法制备待测溶液，依法测定并计算回收率。见表1。

表1 甜菜碱加样回收试验结果（n＝6）

2．4 样品含量测定

取3批样品，按拟订方法测定。结果批号为110901，110601，110602 的样品中每份含甜菜碱 1．170 8，1．002 6，1．216 4 mg(n＝2)。

3 讨论

提取方法的选择：本试验中考察了索氏提取、超声和回流等提取方法，结果3种方法所得结果基本一致，而超声提取操作简便、快捷，故选择超声作为样品提取方法。还对提取溶剂种类及浓度（甲醇、70%甲醇、50%甲醇和乙醇）和提取时间进行了考察，结果以甲醇超声提取30 min效果最佳。

色谱柱的选择：本试验中曾采用十八烷基键合硅胶色谱柱进行试验，结果不理想，甜菜碱在C18柱上难以保留，达不到理想的分离效果。根据甜菜碱极性较大的特性，选择HILIC柱，结果满意。

质谱条件的选择：本试验中曾比较了正负2种离子模式下检测，结果以正离子模式下检测的灵敏度较高，故选择正离子模式检测。同时，因甜菜碱为小分子物质，其分子离子峰[M＋H]＋ m／z为118，在选择离子（SIR）模式下易产生干扰，故选择多反应监测模式，以 118．20→57．92 和 118．20→59．00 为定量离子对。

与传统薄层扫描法比较：曾参照2010年版《中国药典（一部）》枸杞子生品项下甜菜碱的含量测定方法测定了3批样品中甜菜碱的含量，与试验中建立的液相色谱－串联质谱联用法所测得的结果比较，含量普遍偏低。分析原因，应是传统薄层扫描法前处理复杂、显色困难所致。本试验中所建立的供试品溶液处理方法简便、快捷，不仅大大节省了人力、节约了成本，而且所测得的结果更加真实可靠，更能反映样品中甜菜碱的真实含量。

参考文献：

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