胡椒碱对乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF－7／ADM细胞的逆转作用

赖 艳，温 悦，卢来春

（中国人民解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所药剂科，重庆 400042）

肿瘤细胞多药耐药(MDR)的产生是导致肿瘤患者化学治疗（简称化疗）失败的主要原因之一，其中由MDR1基因编码的P－糖蛋白（P－gp)的过度表达是肿瘤细胞多药耐药产生的主要原因[1－2]。逆转肿瘤细胞多药耐药，恢复其对化疗药物的敏感性是目前研究的重点。胡椒碱是从黑胡椒和筚茇中提取的植物生物碱，近年来其抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、抗惊厥和免疫调节等生物活性广受重视。本研究中就胡椒碱对人乳腺癌阿霉素(ADM)耐药细胞株MCF－7／ADM细胞的增殖情况的影响进行了观察，探讨胡椒碱对 MCF－7／ADM细胞上 P－gp的表达影响，为阐述胡椒碱逆转 MCF－7／ADM细胞可能的作用机制奠定了基础。

1 材料与方法

1．1 主要试药与仪器

胡椒碱(纯度大于98%，成都曼思特公司生物科技有限公司)；阿霉素（ADM，深圳万乐药业有限公司，规格为 10 mg）；CCK－8试剂盒(Cell Counting Kit－8，碧云天公司）；兔抗人 P－gp（一抗）及HRP标记羊抗兔IgG（二抗）购自北京博奥森生物有限公司；兔抗鼠β－actin单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG均购自美国Santa Cruz公司。凝胶电泳仪、垂直电泳槽、蛋白质半干转印仪均购自美国Bio－Rad公司。

1．2 细胞培养

人乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF－7／ADM购自南京凯基生物科技发展有限公司。MCF－7／ADM细胞培养于含10%胎牛血清、1 000 ng／mL ADM、100 U ／mL 青霉素、100 μg／mL 链霉素的RPMI1640培养基中(添加ADM以维持细胞的耐药性)。细胞置37℃及5%CO2饱和湿度培养箱中长期传代培养。试验前2周将MCF－7／ADM细胞撤药，置不含 ADM的培养基中培养。所有试验均选取对数生长期细胞进行。

1．3 试验方法

对 MCF－7／ADM细胞的毒性作用(CCK－8法检测)：较MCF－7／ADM细胞，按5 000个 ／孔接种于96孔培养板，24 h后即可加药，设试验组、对照组和空白组。试验组加入不同梯度浓度的胡椒碱，每一浓度设3个复孔，每孔终体积为200 μL。培养48 h后，每孔加入20 μL的CCK－8，继续培养3 h，于酶标仪490 nm波长测光密度(OD)值。取3个孔的平均 OD值，按公式计算细胞存活率（LCS）及细胞抑制率（IR），LCS(%)＝(试验组 OD值－空白组 OD值)／(对照组 OD值－空白组 OD值)×100%。IR(%)＝1－LCS。

对 MCF－7／ADM细胞的耐药逆转作用(CCK－8法检测)：试验分为4组。对照组为MCF－7／ADM细胞（未加药物)；试验组则根据选定的胡椒碱无毒浓度，设定高、中、低3个浓度的胡椒碱和MCF－7／ADM细胞共同培养，每个浓度设3个复孔，每孔终体积为 200 μL。培养 48 h 后，每孔加入 20 μL 的 CCK － 8，继续培养3 h，于酶标仪490 nm波长处测光密度(OD)值，试验重复5次，取其平均值，检测胡椒碱对MCF－7／ADM细胞的耐药逆转作用。计算出半数抑制率的ADM质量浓度(IC50)。细胞耐药逆转倍数＝对照组细胞 IC50／试验组细胞 IC50。取3个孔的 OD值均数，按公式计算细胞存活率（LCS）及细胞抑制率（IR）。

对 MCF－7／ADM细胞 P－gp表达的影响(Western－blot法检测)：收集与胡椒碱共同培养48 h的MCF－7／ADM细胞，抽提总蛋白，以 β－actin为内参，进行蛋白质印迹法分析。总蛋白100℃高温变性后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳;凝胶湿式电转移法转膜，100 V电压条件下电转移60 min；置10%脱脂奶粉 TBST缓冲液中，室温平摇2 h进行封闭；以 β－actin一抗(1 ∶500)及 P －gp一抗（1∶500）稀释，4℃孵育过夜后漂洗，与羊抗人 IgG(1 ∶5 000)、羊抗鼠（1 ∶5 000）室温下孵育 1 h，漂洗后ECL显像，每组至少重复3次试验。

1．4 统计学处理

所有数据均用SPSS 11．5统计软件处理。计量数据以表示，两样本间均数比较采用 t检验。P＜0．05表示差异有统计学意义。

2 结果

2．1 胡椒碱对MCF－7／ADM细胞无毒剂量的筛选

胡椒碱对MCF－7／ADM细胞无毒剂量的筛选，是尽量减少胡椒碱本身的细胞毒作用，胡椒碱的无毒剂量范围应设定为抑制率低于10%。胡椒碱对MCF－7／ADM细胞无毒剂量筛选结果为120 μmol／L。

2．2 胡椒碱对MCF－7／ADM细胞的耐药逆转

试验结果显示，不同浓度的胡椒碱对MCF－7／ADM细胞均有一定程度的耐药逆转作用，且无毒剂量范围是60～100 μmol／L，逆转作用随着胡椒碱浓度的升高而增加，见表 1 。60，80，100 μmol／L胡椒碱试验组细胞耐药逆转倍数分别为 1．62，2．08，3．78 倍，呈浓度依赖性（P ＜0．05），见表 2。

表1 不同浓度胡椒碱作用48 h后ADM对MCF－7／ADM细胞存活率影响的变化（%，n＝3）

表2 不同浓度胡椒碱对MCF－7／ADM细胞耐药的逆转作用

2．3 Western－blot试验结果

加入不同浓度胡椒碱和MCF－7／ADM细胞共同培养48 h后，随着胡椒碱浓度的增加，P－gp蛋白所在条带灰度依次减弱，见图1。可见，随着胡椒碱浓度的增加，MCF－7／ADM细胞表面的P－gp表达量逐渐减少。

图1 胡椒碱对MCF－7／ADM细胞中P－gp蛋白表达的影响

3 讨论

肿瘤细胞多药耐药是肿瘤细胞对化疗药物毒性损伤最重要的自我保护性防御机制。其发生是多阶段、多基因参与的复杂过程，克服肿瘤细胞多药耐药，增加肿瘤对化疗药物的敏感性，提高肿瘤化疗的效果，有着重要的临床意义。目前，对肿瘤细胞多药耐药的研究主要集中在其发生的机制、逆转药物的寻找和多药耐药逆转方法的开发等几个方面，寻找并开发高效、低毒、能够逆转肿瘤多药耐药性的药物是目前研究的重要课题[3－4]。

胡椒碱具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、抗惊厥和免疫调节等生物活性[5－7]。细胞试验表明，与胡椒碱短期接触有可能抑制肠道上皮细胞P－gp的功能[8]，而P－gp的高表达被认为是肿瘤多药耐药的主要原因。胡椒碱是否逆转肿瘤细胞多药耐药性，至今未见文献报道，值得深入研究。

本研究中选择乳腺癌多药耐药的MCF－7／ADM细胞，考察了在无毒剂量范围内胡椒碱和阿霉素联用对MCF－7／ADM细胞的逆转作用。结果表明，在 60～1 500 μmol／L的浓度范围内，随着胡椒碱浓度的升高逆转作用增强；60，80，100μmol／L胡椒碱试验组细胞耐药逆转倍数分别为 1．62，2．08，3．78 倍，呈浓度依赖性；Western－blot结果表明，胡椒碱能降低P－gp的表达水平，并呈剂量依耐性。因此推断，胡椒碱可能通过抑制P－gp的表达，提高药物在细胞内的聚集，增强药物对肿瘤细胞的敏感性，从而发挥杀死肿瘤细胞的作用。

参考文献：

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