离子交换树脂对藤黄果中羟基柠檬酸的分离纯化

易馨如 封 棣 王 泰 张丞林 曹学丽

YI Xin－ru 1，2，3，4 FENG Di 1，2，3，4 WANG Tai 1，2，3，4 ZH ANG Cheng－lin 1，2，3，4 CAO Xue－li 1，2，3，4

（1.北京工商大学食品学院，北京 100048；2.食品添加剂与配料北京市高等学校工程中心，北京 100048；3.北京市食品风味化学重点实验室，北京 100048；4.食品质量与安全北京实验室，北京 100048）

（1.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing 100048，China；2.Beijing Laboratory for Food Quality and Safety，School of Food and Chemical Engineering，Beijing 100048，China；3.Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry，Beijing 100048，China；4.Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China）

羟基柠檬酸（hydroxycitric acid，HCA）是一种天然有机酸，主要存在于盛产于印度次大陆和斯里兰卡西部的藤黄属植物 Garcinia cambogia、Garcinia indica 和Garcinia atroviridis的果实外壳中。此外，羟基柠檬酸在木槿（Hibiscus）属植物中也有存在［1］。羟基柠檬酸易溶于水，微溶于甲醇，难溶于氯仿、石油醚和苯；分子式为C6H8O8，相对分子量为208.12，结构式见图1。研究［2］发现，羟基柠檬酸对柠檬酸裂解酶的亲和力要比天然底物（柠檬酸）强很多，会优先与酶结合，抑制柠檬酸裂解酶的活性，减少体内脂肪合成。因此，羟基柠檬酸具有降低体重［3］、降低血脂［4］、抑制食欲等功效［5］，常被作为天然减肥保健品中的主要功能成分。目前国外已有14种以上含有羟基柠檬酸的减肥保健品上市［6］，而中国国内市场上已有多种相关的功能性食品和保健品［7］。

图1 羟基柠檬酸的化学结构式Figure 1 The chemical structure of hydroxycitric acid

目前国内外学者对于羟基柠檬酸的分离纯化研究较少。Moffett等［8］以藤黄果皮为原料，以水为提取溶剂进行提取，提取液先通过阴离子交换树脂柱，用NaOH溶液洗脱，洗脱后的液体再通过阳离子交换树脂，最终制备得到23%～54%含量的羟基柠檬酸浓缩物。中国市场上销售的“藤黄果提取物”产品大多是依据此法进行生产的，其中羟基柠檬酸含量较低。离子交换树脂是一种有机高聚物吸附剂，在中草药有效成分的提取、分离及纯化中具有广泛的应用。其具有吸附迅速，解吸容易等良好的吸附性能，可用于水溶性化合物的分离纯化中，如小麦活性肽［9］等的分离纯化。对离子交换树脂高效分离纯化羟基柠檬酸相关研究尚未见报道。

本研究拟以藤黄果粗提物为起始原料，通过对不同的离子交换树脂进行筛选，研究静态和动态对羟基柠檬酸纯化的影响因素，以及分离纯化工艺参数的优化，探索出更适合工业化生产、操作简便、低成本、纯化效果好的工艺路线。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

藤黄果粗提物：购买于北京市场；

羟基柠檬酸（HCA）对照品：纯度98.70%，上海佰年诗丹德检测技术有限公司；

离子交换树脂：D315、D201、D301、335、HZ－202树脂，河北沧州宝恩吸附材料科技有限公司；

甲醇：色谱醇，美国Fisher公司；

磷酸：色谱纯，天津市光复精细化工研究所；

NaCl、NaOH、KOH：分析纯，北京化工厂；

氨水、醋酸、盐酸、硫酸：分析纯，北京化学试剂公司；

去离子水、超纯水：本实验室自制。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪：Agilent 1100型，美国Agilent公司；

超声波清洗器：KQ5200DE型，昆山市超声仪器有限公司；

超纯水制备系统：Milli－Q型，美国Millipore公司。

1.3 试验方法

1.3.1 树脂预处理 树脂用去离子水不停冲洗，洗至泡沫较少，水颜色较浅为止，再用3倍体积4%NaOH浸泡3 h，去离子水洗至中性；然后用3倍体积4%HCl浸泡3 h，去离子水洗至中性；最后用3倍体积4%NaOH浸泡3 h，去离子水洗至中性；浸泡备用［10］。

1.3.2 树脂的物理参数 选择型号为 D315、D301、D201、335、HZ－202这5种离子交换树脂进行静态吸附试验，5种树脂的物理参数见表1。

表1 离子交换树脂的物理性质［11，12］Table 1 Physical properties of ion exchange resin

1.3.3 供试品试液的制备 取一定量藤黄果粗提物置于三角瓶中，加入一定量的水，超声提取20 min，过滤，其中的羟基柠檬酸含量待测。

1.3.4 高效液相色谱法对羟基柠檬酸含量及纯度的测定

（1）色谱条件：色谱柱：依利特 Zorbax C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：0.1%磷酸水—甲醇（99∶1），等度洗脱；体积流量0.8 m L／min；检测波长210 mm；柱温30℃；进样体积10μL。

（2）标准曲线的绘制：精密称取羟基柠檬酸对照品10.0 mg，置于1 m L容量瓶中，加入少量超纯水，摇匀使其充分溶解，再定容至刻度，配成质量浓度为10 mg／m L的标准品溶液，4℃冰箱储存备用。量取羟基柠檬酸标准品溶液适量，用超纯水逐级稀释成质量浓度为1.0，0.5，0.2，0.1，0.01，0.005 mg／m L的标准品溶液。用0.45μm微孔滤膜过滤后，分别进样，每个质量浓度重复3次，测定峰面积积分值。以羟基柠檬酸质量浓度对峰面积平均值进行线性回归，得回归方程Y＝637.47 X＋1.831 7（R2＝0.999 9）在5～1 000μg／m L处与峰面积呈良好线性相关。

1.3.5 静态吸附与洗脱研究

（1）静态吸附试验筛选树脂：① 吸附率的测定［13］：分别称取2 g（湿重）预处理好的 D315、D201、D301、335、HZ－202树脂，置于5个100 m L具塞锥形瓶中，加入质量浓度为2.82 mg／m L的羟基柠檬酸溶液20 m L，静置过夜后取上清液测定羟基柠檬酸的质量浓度，按式（1）、（2）计算羟基柠檬酸的吸附量和吸附率。

式中：

q——吸附容量，mg／g；

E——吸附率，%；

C0——吸附前样液中羟基柠檬酸质量浓度，mg／m L；

C1——吸附后样液中羟基柠檬酸质量浓度，mg／m L；

V1——加入粗提液体积，m L；

W——树脂质量，g。

② 解吸率的测定［11］：取上述静态吸附饱和后的树脂，分别置于5个100 m L具塞锥形瓶中，用蒸馏水洗涤后，分别加入1 mol／L NaCl溶液20 m L，静置过夜后取上清液测定羟基柠檬酸的质量浓度，按式（3）计算树脂的解吸率。

式中：

E＇——解吸率，%；

C——解吸后样液中羟基柠檬酸质量浓度，mg／m L；

C0——吸附前样液中羟基柠檬酸质量浓度，mg／m L；

C1——吸附后样液中的羟基柠檬酸质量浓度，mg／m L；

V2——加入洗脱液体积，m L；

V1——加入粗提液体积，m L。

（2）吸附动力学曲线：在100 m L具塞锥形瓶中，加入2 g（湿重）预处理好的D201树脂和浓度为2.82 mg／m L的羟基柠檬酸溶 液 20 m L，吸取 15，30，45，60，120，240，360 min时的上清液，测定羟基柠檬酸的质量浓度，按式（1）计算羟基柠檬酸的吸附容量并绘制静态吸附曲线。

（3）解吸动力学曲线：在100 m L具塞锥形瓶中，加入2 g（湿重）吸附羟基柠檬酸的D201树脂，用蒸馏水洗涤后，再加入1 mol／L的 NaCl溶液20 m L，吸取15，30，45，60，120，240，360 min时的上清液，测定羟基柠檬酸的质量浓度，按照式（3）计算树脂的解吸率并绘制静态解吸曲线。

（4）静态吸附试验选择最优p H值：分别称取5份2 g（湿重）预处理好的D201树脂，置于5个100 m L具塞锥形瓶中，加入质量浓度为2.82 mg／m L的羟基柠檬酸溶液20 m L，p H值分别调为2，3，5，7，9，测定上清液中羟基柠檬酸的质量浓度，按式（1）计算饱和吸附容量。

（5）解吸溶液的选择：在8个100 m L具塞锥形瓶中，加入2 g（湿重）吸附羟基柠檬酸的D201树脂，用蒸馏水洗涤后，分别加入1 mol／L NaOH、NaCl、KOH、氨水、醋酸、磷酸、盐酸、硫酸溶液20 m L，取上清液测定羟基柠檬酸的质量浓度，按式（3）计算树脂的解吸率。

（6）解吸液浓度的选择：分别称取2 g（湿重）吸附羟基柠檬酸的D201树脂，置于10个100 m L具塞锥形瓶中，用蒸馏水洗涤后，分别加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mol／L NaCl水溶液20 m L，取上清液测定羟基柠檬酸的质量浓度，按照式（3）计算树脂的解吸率。

1.3.6 动态吸附与洗脱研究

（1）上样浓度对树脂吸附的影响：将上样浓度分别调为3.12 mg／m L和6.81 mg／m L，均以1.0 m L／min的流速通过高径比为11（树脂20 g）的树脂。每10 m L收集一管洗脱液，测每管羟基柠檬酸含量，考察上样浓度对树脂吸附性能的影响。

（2）上样流速对树脂吸附的影响：将上样浓度调为3.12 mg／m L，分别以1.0，3.0 m L／min的流速通过高径比为11（树脂20 g）的树脂。每10 m L收集一管洗脱液，测每管羟基柠檬酸含量，考察上样流速对树脂吸附性能的影响。

（3）解吸液浓度对树脂洗脱的影响：分别配制0.4，1.0 mol／L的 NaCl溶液作为解吸液，以1.0 m L／min的流速分别洗脱吸附羟基柠檬酸的树脂，每10 m L收集一管洗脱液，测每管羟基柠檬酸含量，考察解吸液浓度对树脂洗脱的影响。

（4）解吸液流速对树脂洗脱的影响：以0.4 mol／L的NaCl溶液作为洗脱液，分别采用1.0，3.0 m L／min的流速洗脱吸附羟基柠檬酸的树脂，每10 m L收集一管洗脱液，测每管羟基柠檬酸含量，考察解吸液流速对树脂洗脱的影响。

1.3.7 羟基柠檬酸的纯化 经D201树脂吸附与解吸后，将解吸液收集，并以1 m L／min的流速通过预处理好的001×7阳离子交换树脂柱，去除解吸液中的Na＋杂质离子。收集解吸液，旋转浓缩至一定体积后，真空冷冻干燥，得到较纯的羟基柠檬酸样品。

2 结果与讨论

2.1 静态吸附与洗脱结果分析

2.1.1 离子交换树脂的选择 由图2可知，D201对羟基柠檬酸的吸附率和解吸率均高于其他树脂。D201树脂对羟基柠檬酸的吸附和解吸率最高的原因可能有两个：①D201树脂为强碱性阴离子树脂，羟基柠檬酸根离子容易与树脂上带有的阴离子进行交换，并且该树脂具有交换速度快、交换容量大等特点；②D201树脂为大孔树脂，羟基柠檬酸较易进入到树脂内部而发生交换。因此选择D201树脂做后续试验。

图2 各树脂对羟基柠檬酸静态吸附率、解吸率的比较Figure 2 Adsorption and elution of HCA by different resins

2.1.2 离子交换树脂静态吸附动力学曲线 评价树脂的一个重要指标是树脂的吸附速率，所选的树脂不仅需要有高的吸附量，而且需要有快速达到吸附平衡的能力［10］。由图3可知，D201对羟基柠檬酸为快速平衡型，在2 h内基本达到平衡，其饱和吸附量为27.325 mg／g。

图3 静态吸附动力学曲线Figure 3 Static adsorption kinetic of D201 resin for HCA

2.1.3 离子交换树脂静态解吸动力学曲线 由图4可知，D201树脂在90 min左右就即将达到最高解吸率，解吸基本完全的时间为2 h，此时的静态解吸率为59.7%。

图4 静态解吸动力学曲线Figure 4 Static desorption kinetic of D201 resin for HCA

2.1.4 上样液p H值的选择 由图5可知，在p H值较低的情况下，D201树脂对羟基柠檬酸的吸附容量较低；随着p H值的升高，D201树脂对羟基柠檬酸的吸附容量逐渐增加，当p H值为5时，其吸附容量最大；而随着p H值的进一步升高，树脂的吸附容量逐渐降低。原因可能是，当p H值为5时，羟基柠檬酸的酸根离子较多，增大电荷，从而有利于树脂对羟基柠檬酸的吸附。

图5 上样液p H值对D201树脂吸附容量的影响Figure 5 Effect of p H on adsorption capacity of D201 resin

2.1.5 解吸溶剂的筛选 由图6可知，磷酸、盐酸、硫酸这3种酸对HCA的解吸率均较高，NaCl溶液也有一定的解吸率。但如果选择磷酸、盐酸、硫酸溶液作为洗脱剂，在后续操作时酸根除去难度大。因此选择NaCl溶液进行洗脱，再将洗脱液通过酸性阳离子交换树脂得到羟基柠檬酸，以达到脱盐纯化效果。该方法简单，可操作性强。所以，综合考虑，选择NaCl溶液作为解吸溶剂。

图6 不同解析溶剂解析效果比较Figure 6 Effect of different of eluent by D201 resin

2.1.6 解吸剂浓度的筛选 由图7可知，在低浓度的NaCl溶液对羟基柠檬酸的解吸率不高；随着NaCl溶液浓度的不断增高，在浓度为0.4 mol／L时解吸率达到最高，为83.24%；继续增大NaCl溶液的浓度，解吸率反而减小，因此选择0.4 mol／L NaCl溶液作为解吸剂。

图7 洗脱液浓度对羟基柠檬酸洗脱率的影响Figure 7 Effect of concentration of eluent by D201 resin

通过静态吸附与洗脱研究，得知D201离子交换树脂对羟基柠檬酸的静态吸附饱和容量为27.325 mg／g，静态解吸率为83.24%。D201树脂静态吸附的最佳条件为吸附时间2 h，上样液p H值5；解吸的最佳条件为选用0.4 mol／L NaCl溶液为解吸剂，解吸时间2 h。

2.2 动态吸附与洗脱研究结果分析

2.2.1 上样液浓度的选择 由图8可知，当上样液浓度为3.12 mg／m L时，羟基柠檬酸在D201树脂上的穿透体积为130 m L，穿 透 容 量 为 45.63 mg／g；当 上 样 液 浓 度 为6.81 mg／m L时，羟基柠檬酸在D201树脂上的穿透体积为60 m L，穿透容量为35.91 mg／g。由此可知，上样液浓度低有利于树脂交换。离子交换树脂有一定的交换容量，若上样液浓度大，树脂与吸附离子间不能够完全交换，树脂很容易出现渗漏。因此选择3.12 mg／m L做为后续试验的上样浓度。

2.2.2 上样液流速的选择 由图9可知，当上样液流速为1 m L／min时，羟基柠檬酸在D201树脂上的穿透体积为130 m L，穿透容量为45.63 mg／g；流速为3 m L／min时，羟基柠檬酸在D201树脂上的穿透体积为50 m L，穿透容量为17.8 mg／g。由此可知，较小的流速利于树脂的吸附。若流速过大，上样液与树脂之间的接触时间短，会导致树脂来不及吸附上样液就发生渗漏。因此本试验选择上样液流速为1 m L／min做后续试验。

图9 上样液流速对树脂吸附的影响Figure 9 Effect of sample rate on D201 resin adsorption of HCA

2.2.3 洗脱液浓度的选择 由图10可知，当NaCl溶液浓度为0.4 mol／L，即洗脱液浓度较小时，出峰较快，洗脱峰型较集中，洗脱峰值较高；而当NaCl溶液的浓度为1 mol／L，即洗脱液浓度较大时，峰型分布不均匀，出峰较慢，洗脱峰值较低。因此选择浓度为0.4 mol／L NaCl溶液来洗脱羟基柠檬酸。

图10 不同浓度洗脱液对羟基柠檬酸的洗脱Figure 10 Effect of eluent concentration on D201 resin elution of HCA

2.2.4 洗脱液流速的选择 由图11可知，不同的洗脱流速对洗脱峰型并没有太大影响，但选择较小的洗脱液流速，洗脱液有较充分的时间与树脂交换，羟基柠檬酸的洗脱峰值较高。因此选择1.0 m L／min的洗脱液流速较为合适。

图11 不同洗脱液速度对羟基柠檬酸的洗脱Figure 11 Effect of eluent rate on D201 resin elution of HCA

通过动态吸附和洗脱研究，得知当上样液浓度3.12 mg／m L、上样液流速1 m L／min时树脂对羟基柠檬酸的吸附较完全；当洗脱液NaCl浓度为0.4 mol／L、洗脱液流速为1 m L／min时，对羟基柠檬酸的解吸效果较好，洗脱峰值较高。

2.3 离子交换树脂纯化后羟基柠檬酸纯度

羟基柠檬酸标准品经超纯水溶解，依1.3.4（1）的方法进行HPLC分析，如图12所示，保留时间5.280 min的为羟基柠檬酸，纯度大于98%。

藤黄果粗提物水溶液，依1.3.4（1）的方法进行 HPLC分析，如图13（a）所示，经保留时间及峰高增高法定性为羟基柠檬酸，通过外标定量法，计算得到粗产品中羟基柠檬酸和含量为40.3%。

经D201及001（7离子交换树脂纯化后的样品收集，依1.3.4（1）的方法进行 HPLC分析，如图13（b）所示，经外标定量法，计算得到经离子交换树脂纯化后羟基柠檬酸的纯度为91.3%。

图12 羟基柠檬酸标准品色谱图Figure 12 Chromatogram of HCA standard

图13 羟基柠檬酸纯化前后色谱图Figure 13 Chromatogram of unpurified and purified of HCA

3 结论

通过5种型号阴离子交换树脂静态吸附和解析的比较，发现D201型离子交换树脂对羟基柠檬酸的吸附量大、吸附率高，并易解吸，具有高的吸附率和解析率，适用于羟基柠檬酸的纯化研究。D201树脂纯化羟基柠檬酸的最佳工艺条件为：上样液 p H 5，上样液质量浓度3.12 mg／m L，洗脱液0.4 mol／L的 NaCl溶 液，上 样 流 速 与 洗 脱 流 速 均 为1 m L／min。结果显示：经D201型离子交换树脂纯化后羟基柠檬酸纯度由40.3%提高到了91.3%，得率为10.8%。表明，D201树脂对羟基柠檬酸的分离纯化具有良好的选择性和应用前景。

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