γ⁃氨基丁酸代谢旁路在植物响应逆境胁迫中的作用机制研究

杨泽伟，王龙海，朱 莉，郎志宏，罗学刚

干旱、盐碱、低温、重金属污染、病虫害等逆境胁迫对农作物的生长发育造成严重的不良影响，成为全球农业减产的重要因素之一［1］。植物在逆境胁迫下会在分子、细胞、生理和生化等不同水平上做出响应，产生各种胁迫耐受机制，以求在逆境条件下得以生存［2］。已有的研究表明，γ⁃氨基丁酸（γ⁃aminobutyric acid，GABA）代谢途径作为三羧酸循环的一个旁路在植物体内发挥着重要的生物学作用：通过调节胞质pH调节酸碱平衡，诱导乙烯等激素合成，以及通过渗透调节提高植物的适应性等作用；参与植物体内碳／氮源平衡，植株生长发育及形态建成等多种生理生化及代谢过程；调节与逆境胁迫相关的基因表达及蛋白质的合成，增强植物的抗逆性；作为一种可能的信号分子在病虫害防治方面发挥重要作用［3～7］。有关γ⁃氨基丁酸代谢旁路在植物生长发育、信号转导和抗逆性等方面的作用机制研究是当前研究的一个热点和难点。本文就γ⁃氨基丁酸代谢旁路在植物逆境胁迫响应中的作用机制及其生物学功能做一简要概述。

1 γ⁃氨基丁酸代谢旁路酶学结构解析

γ⁃氨基丁酸（GABA）是一种在生物体内普遍存在的四碳非蛋白质氨基酸，其合成与代谢主要是通过三羧酸（tricarboxylic⁃acid，TCA）循环的一个旁路即GABA旁路（GABA⁃shunt）进行的，该旁路是由三种关键酶，即位于胞质中的谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）、位于胞质或线粒 体 中 的 γ⁃氨 基 丁 酸 转 氨 酶 （GABA transaminase，GABA⁃T），以及定位于线粒体中的琥珀酸半醛脱氢酶（succinic semialdehyde dehy⁃drogenase，SSADH）组成（图 1）。

图1 γ⁃氨基丁酸代谢旁路结构示意图［8］Fig.1 The structure schematic of GABA shunt［8］.

1.1 谷氨酸脱羧酶（GAD）

前人研究结果表明，谷氨酸脱羧酶（GAD）主要由4个典型的结构域组成：①N端结构域Ⅰ：由第1～57氨基酸残基组成，该结构域对GAD二聚和六聚体的形成与稳定至关重要；②大结构域Ⅱ：由第8～347氨基酸残基组成，其中包含一个磷酸吡哆醛酶类（pyridoxal 5′⁃phosphate，PLP）所特有的α／β折叠结构以及一个辅因子的结合位点；③小结构域Ⅲ：由第348～448氨基酸残基组成，包括3个α⁃螺旋结构和4个反向平行的β⁃片层；④C端结构域Ⅳ：由一个pH感应位点和一个钙调素结合结构域（calmodulin binding domain，CaMBD）组成，能够感知胞质周围环境pH的变化，或与钙粘蛋白CaM结合，通过Ca2＋／CaM调节酶活性变化［9］。研究表明GAD主要位于细胞质中，其活性受细胞环境pH和／或Ca2＋／CaM调节，能够不可逆地催化谷氨酸脱去羧基形成GABA。GAD酶活性水平在植株处于正常生长发育环境时通常比较低，而当植株细胞所处环境pH大于正常生理pH时，GAD通过与CaM紧密结合，激活其酶活性；当细胞环境为酸性条件（pH＜6）时，GAD酶蛋白的C端CaMBD结构域不能与CaM稳定结合，其酶活性则主要依赖于 pH来调控［10］。以上研究表明逆境胁迫下植物细胞中GAD主要依赖于所处环境的pH以及Ca2＋／CaM结合协同调控其酶活性，通过大量合成GABA以有效地响应各种逆境胁迫。

1.2 GABA 转氨酶（GABA⁃T）

作为γ⁃氨基丁酸代谢旁路的第二个关键酶，GABA⁃T主要负责GABA的分解代谢。通过亚细胞定位发现GABA⁃T不仅存在于细胞质，也存在于质体和线粒体中［11］。在细胞质中合成的GABA通过转运蛋白（GABAP）运送到线粒体中，经GABA⁃T酶的催化作用可逆性地分解形成琥珀酸半醛（succinic semialdehyde，SSA）。 目前研究发现在植物体中存在两种类型的GABA⁃T，其中一种是在烟草和拟南芥等多种植物中发现的、主要以丙酮酸作为氨基受体的 GABA⁃TP［12］，另一种则是在烟草、小麦、大豆和萝卜中发现的、主要以α⁃酮戊二酸作为氨基受体的GABA⁃TK，其活性远低于GABA⁃TP，其生物学功能还有待于进一步证实［3］。 Akihiro 等［13］从番茄处于成熟后期的果实中分离鉴定到具有较高活性的、能以α⁃酮戊二酸作为氨基受体的GABA⁃TK，该酶对GABA的分解代谢起着重要作用。此外，Clark等［11］在拟南芥中发现缺失N端信号肽的AtGABA⁃T可以乙醛酸作为氨基受体，说明GABA还有可能参与乙醛酸的代谢。

1.3 琥珀酸半醛脱氢酶（SSADH）

SSADH是γ⁃氨基丁酸代谢旁路的最后一步的关键酶，能够可逆性地催化琥珀酸半醛形成琥珀酸，后者进入三羧酸循环。SSADH主要以NAD＋为辅助因子，NADH对其活性有抑制作用，NADH浓度越高，SSADH酶活性越低。当NAD＋／NADH比率为1时，SSADH活性会降至最大活性的10%以下；当NAD＋／NADH比为0.5时，SSADH活性则被完全抑制。SSADH酶活性会受到ATP的反馈调节［8］，并且 AMP、ADP 和 ATP 分别是NAD＋与SSADH互作的竞争性、复合竞争性和非竞争性抑制剂［14］。 Bouché等［8］研究发现拟南芥中SSADH编码基因的突变会影响线粒体电子传递的过程，说明植物体中SSADH主要位于线粒体中。

2 γ⁃氨基丁酸代谢旁路在逆境胁迫中的生理生化机制

高等植物中GABA代谢旁路在植物细胞响应逆境胁迫和增强植物抗逆适应性方面发挥着重要的作用［15～17］。 已有的研究表明，GABA 的生理生化作用主要与植物在逆境条件下的应激反应有关，逆境胁迫会导致植物体内大量积累GABA［18］。植物在正常生长条件下其体内GABA含量通常比较低，其内源水平一般维持在0.03～32.5μmol／g·FW 范围内，当植物受到逆境胁迫（如机械损伤、干旱、盐碱、缺氧、冷害、高温及病虫侵袭等）时，体内GABA会大量合成，其浓度能快速增加几倍甚至几十倍以上［8］。植物在不同逆境胁迫（包括非生物逆境和生物逆境）下，其体内γ⁃氨基丁酸代谢旁路的作用机制有所不同。

2.1 非生物胁迫

植物遭受逆境危害时会形成多种机制来适应和抵抗非生物逆境，近年来研究发现，γ⁃氨基丁酸通过与植株其他逆境相关代谢途径互作，如渗透调节、激素调节和活性氧代谢等方式，来调节细胞对逆境胁迫的响应，增强植株对逆境胁迫的耐受性。当植物遭受逆境胁迫时，体内会大量合成GABA，一种解释是由于逆境胁迫对谷氨酸脱羧酶活性、GAD基因的表达及GABA的合成产生影响，而GABA代谢和含量的变化可能与植物体中的碳／氮源平衡有关。

2.1.1 γ⁃氨基丁酸参与应对水分胁迫 GABA是一种四碳类非蛋白质氨基酸，在正常生理pH条件下属于两性离子，易溶于水，其生化特性与脯氨酸、甜菜碱等渗透小分子类似，在植物遭遇水分胁迫条件下，GABA可以作为小分子渗透调节物质，降低胞质内的渗透水势，提高细胞保水性能，减缓因缺水对植物细胞所造成的伤害［19］。高水平的GABA（25～200 mmol／L）还有通过稳定和保护离体类囊体膜免受有盐存在造成的冰冻损伤的作用［20］。

2.1.2 γ⁃氨基丁酸参与应对盐胁迫 周翔等［21］研究发现，盐胁迫能够诱导玉米幼苗内源脱落酸（abscisic acid，ABA）和 GABA 的合成，用外源NaCl和ABA同时处理玉米幼苗，会诱导GABA的积累呈现加合效应。而用氟草酮（ABA生物合成抑制剂）预处理后，则会降低GABA含量增加的幅度，说明在盐胁迫下ABA具有调节GABA积累的作用。同时研究发现，NaCl和ABA处理后幼苗后会提高谷氨酸脱羧酶的活性，因此推测盐胁迫下诱导先行合成的ABA通过影响胞内第二信使Ga2＋浓度变化来调控谷氨酸脱羧酶的活性，进而诱导GABA的大量合成。Lancien等［22］研究发现，GABA、ABA和乙烯等信号途径之间存在相互作用。逆境胁迫（如干旱、盐碱、冷热胁迫和机械损伤等）能诱导植物体内GABA的积累，同时提高植物体内乙烯和脱落酸（ABA）的含量，而α⁃氨基丁酸（GABA的同分异构体）能竞争性地抑制 1⁃氨基环丙烷⁃1⁃羧酸（ACC） 转化为乙烯［23］。进一步的研究发现，逆境胁迫下GABA代谢旁路可以通过诱导产生的GABA与谷氨酸受体家族结合，与Ca2＋信号途径相互关联，进而调节细胞内Ca2＋水平及其它离子信号相关的胁迫应答反应［10］。

Zhang等［24］通过对烟草在不同程度盐胁迫下的代谢组学分析发现，大约有40种代谢物，包括有机酸／碱、氨基酸、碳水化合物、胆碱、嘧啶和嘌呤等含量发生显著变化。而长时间、高浓度（500 mmol／L NaCl）盐胁迫下会导致脯氨酸、肌醇等渗透物大量积累，GABA代谢途径随之发生相应变化。另外一种解释是GABA的积累可能与腐胺降解途径有关［25］，Dittami等［26］证实了褐藻长囊水云在盐胁迫下其体内GABA含量的增加主要是由腐胺降解途径形成的，说明GABA的积累与多胺氧化降解有关，在植物抗逆生理中发挥作用。罗黄颖等［27］研究发现高盐胁迫会严重抑制玉米种子萌发，但加入外源GABA后可以显著提高玉米种子的萌发率，并提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）这三种抗氧化酶的活性。进一步的研究表明，盐胁迫条件下外源添加的GABA通过提高抗氧化酶的活性和抗氧化剂的含量，降低羟自由基（H2O2）和丙二醛（MDA）的水平，从而提高细胞膜结构的稳定性，减轻盐胁迫对光合系统Ⅱ造成的伤害，增强番茄对盐胁迫的耐受能力。Wongchai等［28］研究发现植物对盐胁迫的响应主要与GABA和水杨酸的拮抗作用有关，证明酸敏感离子通道参与盐胁迫反应。

2.1.3 γ⁃氨基丁酸参与应对低氧胁迫 植物根际在低氧胁迫条件下，其线粒体呼吸链电子传递中由于缺乏最终受体O2，抑制了正常的有氧呼吸，启动无氧呼吸代谢结果造成细胞质酸化。植株细胞内通过激活GAD酶的活性大量合成GABA，在此过程中通过大量消耗H＋，进而缓解了低氧胁迫对植物造成的伤害［29］。细胞内积累的GABA可以通过分解代谢形成琥珀酸，并形成NADH作为TCA循环的反应底物，如果GABA代谢旁路受阻则会削弱线粒体的呼吸作用，从而导致活性氧大量积累［14］。 夏庆平等［30］等研究发现低氧胁迫导致甜瓜幼苗光合作用显著下降，而外源GABA能显著提高低氧胁迫下甜瓜幼苗的光合速率、气孔导度等，该研究为寻找缓解作物无土栽培中低氧胁迫伤害的有效措施提供理论依据。

2.2 生物胁迫

γ⁃氨基丁酸（GABA）的富集直接或间接参与到植物抗生物胁迫的过程中。

2.2.1 γ⁃氨基丁酸影响昆虫的摄食行为 昆虫体内GABA是一种重要的抑制性神经递质，植食性昆虫（phytophagous insect）的取食活动对植物叶子的机械刺激和破坏可以诱导GABA的大量合成，而积累的GABA反作用于昆虫后会影响昆虫的摄食习性。 Ramputh和 Bown［31］研究发现，GABA 含量在 1.6～2.6 μmol／g·FW 范围内就可以减少幼虫的生长率、发育率和存活率。幼虫活动对大豆叶子的机械破坏作用在2 min内可使叶中GABA含量增加10～20倍，达到2μmol／g。这个含量足以抵制幼虫的发育。被昆虫取食而摄入害虫体内的GABA会直接作用于昆虫神经肌肉接合处，抑制昆虫的神经中枢传导过程，抑制害虫的生长和发育从而达到减轻虫害的目的［8］。此外，昆虫摄入体内的GABA通过结合其离子受体，快速激活相应的Cl－离子通道，造成细胞质膜产生超极性化，以阻止可能发生的取食行为［32］。植物组织快速积累的GABA可以影响植食性昆虫的摄食习性，可能是植物的一种自我保护机制［32］。当植物遭受虫害侵袭时，一方面植物体内会快速积累大量的GABA，另一方面，植物由于昆虫取食也会诱发取食部位的GABA大量积累，导致植物细胞胞质酸化，从而阻止昆虫进一步取食。在实际应用中可以通过转基因手段过表达GAD基因，提高GABA表达量，作为增强作物的抗病虫能力的一种有效的防治策略［33］。

2.2.2 γ⁃氨基丁酸作为信号分子调控植物防御反应 Mirabella等［34］研究发现，当植株遭到食草动物、病原菌的侵袭或受伤时，会产生一种六碳乙醇、乙醛和酯的混合物，称作C6⁃挥发物。未受伤的植株当接触到C6⁃挥发物时，会诱导与防御相关的基因和次生代谢物作出相应的反应，表明C6⁃挥发物可以作为信号分子调控植物的防御反应。 用C6⁃挥发物E⁃2⁃己烯醛处理会诱导 GABA的积累，而高浓度的GABA又会赋予植株对E⁃2⁃己烯醛产生抗性，说明GABA可能在介导E⁃2⁃己烯醛反应中发挥关键性的作用。Park等［35］研究发现，GABA可能在假单胞菌与植物互作的过程中具有多重功能，通过提高含量增强植株的抗病能力。

3 γ⁃氨基丁酸代谢旁路在逆境胁迫中的分子作用机制

3.1 γ⁃氨基丁酸合成相关的基因及功能

GABA合成与代谢途径简单、进行遗传操作方便，因此，在诸多抗逆性研究中GABA代谢旁路被看作是最有希望的与胁迫抗性相关的代谢途径之一，得到了广泛研究，尤其是GAD基因，它是GABA合成的关键酶基因。目前，GAD基因已先后在拟南芥［8］、 水稻［33］、 番茄［11］、 人参［36］和玉米［37］中得到分离和鉴定。已鉴定出GAD有多种同源基因，这些同源基因能够在不同组织、不同发育时期特异性地表达，由此导致不同植物品种、不同组织、不同发育时期、不同逆境胁迫下GABA积累机制均有所不同，因而呈现出抗逆性的差异［13，38，39］。 植物中 GABA 含量呈现胁迫特异性积累模式，表明GABA在减缓胁迫方面发挥着重要的生理学作用，但GABA积累在逆境胁迫作用中的具体功能目前尚不清楚。

3.2 γ⁃氨基丁酸分解相关的基因及功能

就目前而言，GABA代谢旁路中研究比较多的是GAD基因，而对涉及GABA分解代谢的γ⁃氨基丁酸转氨酶（GABA⁃T）和琥珀酸半醛脱氢酶（SSADH）基因的研究相对较少。近年来分别在拟南芥、水稻、番茄等作物中克隆鉴定出不同类型的GABA⁃T，研究发现这些基因虽然同源性很高，但基因表达呈现出发育和组织器官的特异性，亚细胞分布也具有多样性［9，40］。已有的研究表明，GABA⁃T在逆境胁迫中发挥着重要的作用：Fait等［14］研究发现 GABA⁃T 抑制剂 γ⁃乙烯基⁃γ⁃氨基丁酸（VGB）可抑制GABA分解代谢，使其含量大幅度提高进而抑制活性氧（ROS）的积累。Kim等［41］研究发现在NaCl胁迫下，水稻幼苗体内与抗氧化相关的基因表达量上调，可溶性物质脯氨酸和GABA含量显著增加，GABA⁃T基因转录表达上调。但是GABA⁃T基因的表达与GABA的积累和盐胁迫响应之间存在什么样的关联尚不清楚。

植物在低氧胁迫时其体内会大量积累GABA，同时丙氨酸含量也显著提高，而研究发现拟南芥的谷氨酸脱羧酶突变体gad1和GABA转氨酶突变体gaba⁃t1中，不仅GABA合成受到影响，丙氨酸的合成也受到gaba⁃t1同时抑制，说明GABA代谢旁路影响着低氧胁迫时丙氨酸的代谢，也进一步说明植物在逆境条件下以GABA为碳和氮储存库是一种重要的适应机制［42］。Mira⁃bella等［34］研究证实 GABA⁃T基因的突变会导致GABA代谢受阻，造成GABA的积累，而高水平的GABA可能在介导E⁃2⁃己烯醛诱导与防御相关的基因和次生代谢物反应中发挥关键性的作用。Simpson 等［43］研究发现 GABA⁃T 在拟南芥遭受冷胁迫时有限制GABA分解代谢的功能，而在NaCl胁迫响应过程中GABA代谢整体呈上调趋势，尤其是GABA⁃T在其中发挥着关键性的作用，作为GABA代谢反应的第一步酶，GABA⁃T对NaCl最为敏感，该步骤的损伤会降低植株的耐盐性，表明GABA的积累可能是拟南芥耐盐性的一个决定因素［18］。因此通过基因工程技术培育过表达GABA⁃T的转基因植株或筛选具有GABA⁃T高活性的植株可以作为提高作物抗逆境胁迫的一种策略。

Busch和Fromm［44］首次从拟南芥中克隆出琥珀酸半醛脱氢酶（SSADH）基因，该基因的缺失突变导致植株对光和热等环境胁迫很敏感，其体内活性氧中间体（ROIs）含量增加远远高于野生型，表现出炭疽病、植物矮化以及对胁迫环境超敏感等特征，致使细胞加速凋亡［8］。对拟南芥的研究还发现，胁迫条件下ssadh基因突变会导致一种GABA 异 构 体 γ⁃羟 基 丁 酸 （ γ⁃hydroxybutyrate，GHB）的含量增加 5 倍，而用外源 γ⁃乙烯基⁃γ⁃氨基丁酸（γ⁃氨基丁酸转氨酶专一性抑制剂）处理突变体后，ROIs和GHB的积累受到影响，说明GABA代谢旁路的正常运转能够抑制ROIs的积累，分析原因可能在于GABA代谢旁路为TCA循环提供琥珀酸和NADH等反应底物，如GABA代谢旁路受阻则会削弱线粒体中呼吸作用正常运行，H2O2自由基的清除能力减弱，从而导致ROIs大量积累［14］。进一步的研究发现，ssadh缺失突变体出现氧化胁迫和生长延迟与TCA循环中琥珀酸和NADH的供应不足无关，而可能在一定程度上是由于GABA⁃T转氨作用产生的SSA对细胞有毒性，导致ROIs含量较高和植株生长发育受到抑制［45］。以上研究结果表明SSADH是植物体内控制ROIs含量所必需的，可以减少胁迫条件下ROIs对植物造成的伤害。

4 GABA的信号调控作用

植物在逆境胁迫下会应激合成大量的GABA，因此有学者推测GABA可能作为一种信号分子在逆境胁迫中发挥作用。在动物体中已经鉴定出三种类型的 GABA受体：即 GABAA、GABAB和GABAC，其中 GABAB是 G蛋白偶联受体。GABA是通过与这三种受体结合发挥作用的［46］。迄今为止尚未在植物体内鉴定出与动物体中类似的GABA受体，但是已有研究发现GABA可能是通过与植物体中已知的谷氨酸受体结合发挥作用。而这个谷氨酸受体的调节区域与动物体中的GABAB受体结构相似［47］。植物体中谷氨酸受体主要参与谷氨酸信号及钙信号的传导过程，由此推测GABA可能在植物体中起信号分子的作用［8］。研究发现不同浓度梯度的GABA可能作为信号分子引导花粉管的伸长［48］。施加外源GABA能够促进芸苔属植物根系对土壤环境中硝酸盐的吸收利用，表明GABA可能作为长距离信号传导物质在植物体中起关键性的作用［49］。 Mohammad 等［50］研究表明在水稻叶片的程序性凋亡过程中，一种依赖于GABA的丙酮酸转氨酶起正调控作用。拟南芥中研究发现可以通过ABA和乙烯等信号分子的作用途径调节GABA含量水平，并进一步调控编码膜蛋白的14⁃3⁃3基因的表达［22］。 Shi等［51］研究发现在盐胁迫下添加外源GABA处理中间锦鸡儿根部能够激活其体内多重应答机制，主要包括信号传递、蛋白质降解调控、激素合成、活性氧ROS的形成、多胺代谢以及其它代谢机制，进一步说明GABA可能作为一种信号分子，参与植物体内与盐胁迫相关的基因的表达调控。但是植物体内是否存在GABA受体及GABA如何发挥信号传导作用的分子机理有待于进一步验证。

5 展望

近年来，关于GABA在植物体中的生理作用尤其是在逆境胁迫中的作用研究引起了越来越多的关注，并取得了许多突破性进展。已有的研究表明逆境胁迫下GABA在碳氮源代谢、蛋白质降解调控、激素合成、活性氧形成、多胺代谢、信号传递以及与其它代谢机制互作参与植物体内与逆境胁迫相关的基因的表达调控等方面发挥重要的作用，但是各种逆境胁迫中引起GABA积累的确切生理意义及其分子调控机制目前还不清楚。GABA在高等植物体内含量水平的调节以及关于GABA启动的信号传导、GABA在胞内和胞间的运输等，仍需在生化和分子水平上对GABA代谢途径关键环节、关键基因分离和功能鉴定等进行深入的研究。

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