FMDV全ORF编码基因的克隆及其腺病毒载体的构建

高 鹏，李志勇，柳纪省

口蹄疫（foot⁃and⁃mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒所引起的猪牛羊等偶蹄动物的一种急性热性传染病，人也可以感染，属于一种人畜共患的传染病［1］。该病传播途径广、速度快，众多经济动物都是其易感宿主，已经多次在世界范围内暴发流行，给很多国家造成了巨大经济损失。世界动物卫生组织（World Organisation for Animal Health，OIE）已将其列为A类传染病之首［2］。目前，有三分之二的OIE成员国流行FMD，时刻威胁着无FMD国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。在FMD流行地区，FMD的预防和控制主要依赖常规FMD灭活疫苗［3］，FMD疫苗在预防和控制，乃至根除 FMD过程中发挥重要作用。商品化的FMD疫苗大多是化学灭活苗，该疫苗的主要抗原成份为病毒衣壳蛋白（146s），主要依靠体液免疫发挥其作用，而细胞免疫和非结构蛋白免疫作用往往被忽视［4］。此外，商品灭活疫苗存在免疫持续期短的缺点，并且在其生产过程中存在散毒的风险［5］，已成为现阶段许多科研人员关注和解决的问题。

口蹄疫保护性免疫中细胞免疫参与免疫应答提高免疫保护率的机理仍然不清楚，但是现在已有很多研究间接发现口蹄疫病毒（foot⁃and⁃mouth disease virus，FMDV）非结构蛋白在免疫方面有不可忽视的作用，有可能显著提高现有口蹄疫疫苗的免疫效果［6，7］。 Moraes 等［8］利用表达口蹄疫病毒非结构蛋白（NSP）2B的腺病毒载体疫苗免疫牛，发现FMDV非结构蛋白2B能够显著提高腺病毒载体疫苗诱导动物机体CD4＋T细胞和CD8＋T细胞应答的能力，最终提高腺病毒载体疫苗的保护率。近年来在免疫动物的血清中也检测到3A抗体，其原因可能是在3A蛋白上存在诱导特异性反应的抗原位点［9，10］。 郑海学等［11］通过反向遗传操作技术构建了与野生型口蹄疫病毒结构蛋白基因相同、而非结构蛋白和前导蛋白不同的重组病毒，作为抗原免疫豚鼠后，在抗原剂量相同的条件下，重组含非结构蛋白的病毒抗原更能有效诱导CD8＋T细胞亚群，诱导抗体产生效果更好并且攻毒后保护效率更高。此外，在FMDV非结构蛋白上鉴定出的一系列的T细胞表位，进一步证明非结构蛋白在诱导细胞免疫方面具有不可忽视的作用。

诸多研究表明，腺病毒活载体疫苗可以补救灭活苗较多存在的缺陷，以腺病毒载体表达口蹄疫病毒免疫原性基因具有较好的应用前景［12，13］。利用FMDV结构蛋白基因和非结构蛋白基因的不同组合以表达病毒的空衣壳已经成为现阶段研究的焦点［14］，并且已经取得了很多进展，比如P1和3C蛋白酶基因在痘病毒、杆状病毒和腺病毒等表达系统中可产生少量的空衣壳［15，16］。

研究构建含有编码FMDV全目的基因的腺病毒载体可以将FMDV的结构蛋白和非结构蛋白在细胞免疫和体液免疫方面的作用发挥到最大。本研究成功构建了以O型口蹄疫病毒ON毒株的全ORF编码基因（包括 L、P1、P2、P3基因）为外源基因的重组腺病毒载体，以期提高FMDV空衣壳的组装效率及其体液免疫和细胞免疫的整体免疫效力，为FMD复制缺陷型腺病毒活载体疫苗的研制打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 毒株 ON毒株（O型口蹄疫病毒的当今疫苗用毒株），为中国农业科学院兰州兽医研究所传染病室保存的牛源O型FMDV毒株。

1.1.2 载体和菌种 pMD＠19⁃T Simple Vector与大肠杆菌JM109感受态购自TaKaRa公司，腺病毒穿梭载体 pAdTrack⁃CMV、骨架载体 pAdeasy⁃2和FMDV培养用细胞系BHK⁃21等均为中国农业科学院兰州兽医研究所传染病室保存，DH10B感受态细胞购自上海杰美生物公司。

1.1.3 主要试剂 总RNA提取试剂盒QIAamp MinElute Virus Spin Kit为 QIAGEN公司产品；MMLV反转录酶、PrimeSTAR＠GXL DNA Polymerase和DNA Marker为TaKaRa公司产品；限制性内切酶 NotⅠ、Eco RⅤ、PacⅠ和 PmeⅠ，T4 DNA连接酶和碱性磷酸酶为NEB公司产品；质粒DNA小量提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒和DNA纯化试剂盒购自爱思进生物技术公司。

1.2 实验方法

1.2.1 口蹄疫病毒RNA的获取 按照经典方法在P3等级实验室将O型FMDV的ON疫苗毒株接种到BHK⁃21细胞中至细胞病变，收集病毒置－70℃保存待用。然后按QIAGEN公司RNA提取试剂盒的说明，从细胞培养液中提取口蹄疫病毒RNA。以上涉及口蹄疫病毒的实验均在兰州兽医研究所P3等级实验室进行操作。

1.2.2 目的基因的扩增与克隆 将提取的病毒总RNA通过MMLV反转录酶制备cDNA。参考GenBank中O型口蹄疫病毒的相关序列，分别用Primer5.0、Clustal、DNAStar软件进行序列比对设计引物，引物序列见表1。以cDNA为模板，P1、P2为引物通过高保真性PrimeSTAR＠GXL DNA Polymerase扩增ORF基因，以确保整个ORF遗传信息的完整无缺。PCR扩增条件为98℃ 2 min；98℃ 30 s，68℃ 7 min，36 个循环；72℃ 10 min。PCR产物用10 g／L琼脂糖凝胶电泳鉴定及回收。然后将回收产物与高效克隆载体 pMD＠19⁃T Simple Vector连接后（本实验选择的高保真DNA聚合酶的扩增产物是平滑末端，与T载体连接前，需要对扩增产物进行加脱氧腺嘌呤核苷酸接头反应），用热激法转化JM109菌株，通过蓝白斑筛选、PCR鉴定与酶切鉴定得到阳性克隆，命名为pMD＠19⁃T Simple／ORF。 将阳性克隆菌种送苏州金唯智生物技术有限公司进行测序。

表1 目的基因的PCR扩增引物Table 1 PCR primer designed for target gene amplification.

1.2.3 目的基因序列测定结果的分析 用NCBI中的 Blast、MEGA5、DNAMAN 和 DNAStar等软件对测序结果进行核苷酸序列比较和分析。

1.2.4 重组腺病毒穿梭载体的获得 根据张兴旺等［17］的实验方法经内切酶 NotⅠ和 Eco RⅤ双酶切将ORF定向插入穿梭载体。转化和筛选阳性克隆方法同步骤1.2.2。采用酶切、PCR扩增等方法鉴定，得到阳性重组质粒，命名为pAdTrack⁃CMV／ORF。将阳性克隆送苏州金唯智生物技术有限公司进行序列测定，以确保所构建的重组腺病毒穿梭质粒读码框正确。

1.2.5 细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒

先将骨架载体pAdEasy⁃2电击转化大肠杆菌BJ5183，制备携带腺病毒骨架载体的电转感受态菌，电击条件为：2.5 kV，200 Ω，25 μF。 再将重组穿梭载体 pAdTrack⁃CMV／ORF经限制性内切酶PmeⅠ线性化后电击转化自制感受态菌中。电转后将感受态菌在LB培养液中于37℃复苏30 min，取适量菌液涂入含50 mg／mL卡那霉素的培养板中，于37℃温箱培养20 h，挑选单克隆菌落［18］。 用3 mL含有 50 mg／mL卡那霉素的 LB培养液在摇床上37℃培养12 h，小量提取质粒DNA，用8 g／L的琼脂糖凝胶进行电泳迁移率分析，并用PacⅠ进行限制性内切酶图谱分析。将所得的阳性重组腺病毒质粒以上述同样条件电击转化入宿主菌DH10B，在此宿主菌中可获得大量高质量的质粒，并且在该菌内不会再发生同源重组，将此质粒命名为pAd⁃ORF。将阳性克隆送苏州金唯智生物技术有限公司进行序列测定。

1 结果与分析

2.1 FMDV 的细胞病变

将FMDV接种于BHK⁃21细胞上，接毒细胞在10～11 h出现细胞皱缩、变圆，16～20 h则形成FMDV典型的葡萄状细胞病变（图1B，彩图见封三图版），未接毒细胞对照正常生长（图1A）。

图1 病变BHK⁃21细胞的观察Fig.1 BHK⁃21 cells infected by FMDV.

2.2 目的基因的扩增与克隆载体的鉴定

取病毒cDNA的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明，PCR扩增的产物ORF大小约为6.9 kb，与ORF的理论大小相同（图2）。将目的基因克隆到pMD＠19⁃T Simple载体上，通过PCR检测、酶切鉴定（图3）和测序验证，得到含有正确插入片段的重组质粒pMD＠19⁃T Simple／ORF。

2.3 重组腺病毒穿梭载体的的制备和鉴定

通过细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒，电转后通过卡那霉素培养板进行筛选，挑选16个最小的单克隆菌落（图4，彩图见封三图版）进行培养，并提取质粒。重组腺病毒穿梭质粒经琼脂糖凝胶电泳后，选取滞后的条带进行PCR检测和酶切鉴定。重组质粒经PCR扩增出约6 969 bp的目的条带，用限制性内切酶NotⅠ和Eco RⅤ酶双酶切得到约9 194 bp和6 969 bp的条带（图5），与理论预计相符，说明目的基因正确连到了穿梭载体上。再经测序验证，得到含有正确目标基因读码框的重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack⁃CMV／ORF。

图2 病毒cDNA的PCR产物Fig.2 PCR amplification product of virus cDNA.

图 3 重组质粒 pMD＠19⁃T Simple／ORF 的 PCR检测及酶切鉴定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pMD＠ 19⁃T Simple／ORF by PCR amplification and restriction enzymes digestion.

2.4 重组腺病毒质粒的鉴定

图4 同源重组阳性克隆菌的菌落形态选择Fig.4 Colony morphology screening of potential adenovirus recombinants after homologous recombination in AdEasier cells.

图5 重组质粒pAdTrack⁃CMV／ORF的PCR检测及酶切鉴定Fig.5 Identification of recombinant plasmid pAdTrack⁃CMV／ORF by PCR amplification and restriction enzymes digestion.

对重组腺病毒质粒pAd⁃ORF使用PacⅠ进行酶切鉴定，酶切产物的琼脂糖凝胶电泳条带显示两条带，一条带是30 kb左右的大带，另一条是4 500 bp的小带，与理论重组腺病毒质粒大小相符；用引物P1和P2进行PCR扩增检测目的基因，电泳显示扩增出约6 969 bp的条带（图6），表明该质粒pAd⁃ORF含有目的基因片段。测序验证结果显示，重组腺病毒质粒pAd⁃ORF携带正确的FMDV毒株全ORF编码基因，表明含有完整编码基因表达盒的重组腺病毒质粒pAd⁃ORF构建成功。

2.5 序列比对结果

图6 重组腺病毒质粒的PCR检测和PacⅠ酶切鉴定Fig.6 Identification of recombinant adenovirus plasmids by PCR amplification and PacⅠdigestion.

每一步测序之后都经过严格的生物学软件分析（Blast、MEGA5、DNAstar和DNAMAN等），NCBI中 Blast分析其与 O／GSLX／2010、O／SKR／2000 和O strain Yangju的相似性都在 99%以上；经MEGA5分析，插入目的基因的读码框都可以正常翻译，突变位点不影响目的蛋白的表达及活性。

3 讨论

活载体疫苗是近年来基因工程疫苗的研究热点之一，被广泛地认为是一种很具开发前景的基因工程疫苗。而腺病毒载体转导目的基因具有高效率、低致病性、高滴度以及在体内不整合入宿主细胞染色体等优点，已被认为是最有效的转基因载体之一，并广泛应用于各种活载体疫苗的研制［19］。构建编码FMDV抗原的腺病毒载体是研制FMD活载体疫苗的前提。重组腺病毒载体的构建方法及腺病毒载体系统有很多种，可以根据需要采用不同的表达系统及方法。例如根据包装容量大小、根据启动子和报告基因的不同等选择适合的腺病毒表达系统，具体特点如表2所示［20］。

本研究选择了pAd⁃Track CMV作为穿梭质粒，其中插入的GFP报告基因有利于重组腺病毒的检测和效价测定；使用CMV高效启动子［21］，更有利于目的基因的表达。由于不同腺病毒表达系统的包装能力相差比较大，并且本研究中所插入的片段较大，需要一个包装能力较高的系统来包装表达整个ORF，所以我们选择了pAdEasy⁃2作为骨架载体来提高腺病毒系统包装能力，以确保本研究所构建的含有口蹄疫全长ORF基因的腺病毒载体能在后续工作中顺利地包装出带有口蹄疫全长ORF基因的复制缺陷型腺病毒。之前的一些文献报导和研究过程中发现，使用pAdEasy⁃1作为骨架载体对于包装大的基因片段存在包装能比较弱的问题，因此，我们选择的系统可以较好地弥补这一缺陷。

表2 腺病毒表达系统特征Table 2 The characteristics of vector systems.

在真核细胞诸多影响蛋白翻译表达的因素中，Kozak序列 GCCACCAUGG的作用尤为重要［22］，本研究为了进一步提高目的基因在真核表达中的表达效率，研究设计引物时添加了Kozak序列GCCACCATGG以提高外源基因在真核细胞中的表达，从而为后期FMDV的腺病毒缺陷活载体疫苗免疫水平的提高打下基础。

研究已经发现FMDV空衣壳和口蹄疫病毒粒子一样也存在线性及构象位点，抗空衣壳的血清具有血清型特异性［23］，与抗病毒粒子的血清相同，说明空衣壳的免疫原性和完整病毒粒子的免疫原性相同，提示FMDV空衣壳可用于模拟病毒粒子的免疫性。并且非结构蛋白对免疫应答的影响已经越来越引起广大科研者的重视，诸多研究表明完整的非结构蛋白在免疫应答中有重要作用［21］，尤其是对免疫应答中的细胞免疫水平有显著影响。本研究中考虑到整体非结构蛋白对免疫应答的影响，所以大胆地构建了口蹄疫完整的ORF编码区的重组腺病毒载体，使后期免疫中能尽可能地表达所有口蹄疫病毒的抗原表位，从而刺激宿主产生更全面的细胞免疫和体液免疫。这对提高FMD常规疫苗免疫水平、延长免疫持续期具有重要意义。

本实验选择了当前口蹄疫流行的疫苗生产用O型毒株－ON毒株，与之前一些研究中选择的毒株相比更切合实际，较好地与现阶段的生产实际相联系，可以更好地为目前口蹄疫流行毒株的疫苗研究提供有力帮助，为更好地跟进实际生产做好铺垫。并且在前人的基础上改进了实验方法，选择了更搭配的包装载体系统。构建了以FMDV ON毒株全ORF编码的基因（包括 L、P1、P2、P3基因）为外源基因的重组腺病毒载体，为FMDV复制缺陷型腺病毒活载体疫苗的研制奠定了基础。

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