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虫草多糖微波辅助提取工艺的优化

2014-05-02李靖靖方永远

食品与机械 2014年1期
关键词:水料虫草产率

岳 春 李靖靖 方永远

YUE Chun 1 LI Jing-jing 2 FANG Yong-yuan 1

(1.南阳理工学院生化学院,河南 南阳 473000;2.中州大学化工食品学院,河南 郑州 450044)

(1.School of Biotechnology,Nanyang Institute of Technology,Nanyang,Henan 473004,China;2.Chemistry Engineering and Food Experiment Administrative Center Institute of Zhongzhou University,Zhengzhou,Henan 450000,China)

虫草多糖为蛹虫草的重要活性成分,是由甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖等组成的多聚糖,具有提高免疫、抗衰老、抗肿瘤、降血脂、抗动脉粥样硬化、保肝、耐缺氧、镇静等作用[1]。目前对虫草多糖的提取主要采用水热回流法、超声波浸提法、超临界萃取法[2]等,然而水热回流提取法虽然有利于虫草多糖的提取,但耗时过长;超声波提取法具有加速植物中有效成分进入溶剂,增加提取率等诸多有利因素,但在试验中由于多糖提取温度是主要影响因子,而超声波所产生温度仅能达到50℃左右,这不利于多糖溶解[2];超临界萃取法所需的设备要求比较高而且萃取率较低。所以寻求一种高效、快捷的方法变得迫切需要。

微波辅助萃取技术是近年来新发展起来的一种方法,具有穿透性强、选择性高、加热效率高等特点,在接近环境温度下抽提所需的有效成分,对热敏性成分的浸提极为有效。微波技术应用于植物细胞破壁,能有效提高得率,已被广泛应用于各种天然活性成分的提取[3]。

本研究拟将微波辅助提取技术应用于虫草多糖的提取工艺研究,通过响应曲面法设计试验[4],探求微波辅助提取虫草多糖的最佳工艺条件,在充分利用蛹虫草资源的基础上,为虫草多糖的进一步开发利用提供有力的保障。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

蛹虫草:由南阳理工学院生化学院食品实验室提供;

浓硫酸:东莞市力冠化工有限公司;

95%乙醇:广州万从化工有限公司;

无水葡萄糖:北京鹏彩精细化工有限公司;

丙酮:南京化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

高速万能粉碎机:FW-200型,北京中兴伟业仪器有限公司;

电热恒温水浴锅:DK-98-1型,天津市泰斯特仪器有限公司;

电子天平:BS100S型,北京赛多利斯天平有限公司;

旋转蒸发器:RE-201D型,巩义市英峪予华仪器厂;

循环水式真空泵:SHZ-D(Ⅲ)型,巩义市英峪予华仪器厂;

低速大容量离心机:TDL-40B型,上海安亭科学仪器厂;

电热鼓风干燥箱:101-2A型,天津市泰斯特仪器有限公司;

752紫外分光光度计:WF2-2000型,上海龙尼柯仪器有限公司;

微波辅助反应仪:XH-MC-1型,北京祥鹄科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

蛹虫草→干燥→粉碎→脱脂→浸泡→微波辅助提取→离心→真空浓缩→醇沉→静置→脱蛋白→沉淀→烘干(50~60℃)→粗多糖→溶解(20~25倍体积的水)→脱色→离心→浓缩→醇沉→沉淀→真空干燥→精制虫草多糖

1.3.2 操作要点

(1)粉碎:取蛹虫草烘干粉碎后过80目筛。

(2)脱脂:采用石油醚脱脂,按虫草粉∶石油醚=1∶5(m∶V),回流1~2 h。

(3)微波辅助提取:确定好所需的功率、时间、料水比后,辐射1 min,间隔1 min后再辐射1 min,如此间隔辐射直至总辐射时间达到所需要的时间(浸提温度60~80℃,时间30 min),过滤,然后按同样条件重复提取一次。

(4)醇沉:浓缩液冷却后,加入3倍量95%乙醇使其沉淀,取出上清液,沉淀再用少量水溶解,重复2次,之后静置8~24 h。

(5)脱蛋白:采用Sevage法。Sevage试剂:氯仿(三氯甲烷)∶正丁醇=5∶1;利用蛋白质在三氯甲烷等有机溶剂中变性的特点,将提取液与Sevage试剂5∶1混合,振荡离心,变性后的蛋白质介于提取液与Sevage试剂交界处。弃最下面的氯仿层以及中间的蛋白层,留上层水液(正丁醇密度最小,用量也是最小,飘在水液上面,暂时忽略它),然后再进行浓缩和多次醇沉后并用无水乙醇、丙酮和无水乙醚进行多次洗涤[5]。

(6)脱色:将活性碳与含虫草多糖的溶液按固液比1∶5(m∶V)混匀,放置摇床上振摇3 h后取下,过滤除色素。

1.3.3 单因素试验设计 每次精确称取5.0 g蛹虫草粉,分别按照不同的微波功率、微波处理时间、料水比、提取次数进行处理,以多糖产率为评价指标确定各因素的最佳取值范围。各单因素试验的设计:

(1)微波功率对多糖产率的影响:固定料水比1∶30(m∶V),微波处理时间4 min,提取2次。微波功率分别取300,400,500,600,700 W。

(2)料水比对多糖产率的影响:固定微波功率500 W,处理时间4 min,提取2次。料水比分别取1∶20,1∶25,1∶30,1∶35,1∶40(m∶V)。

(3)微波处理时间对多糖产率的影响:固定微波功率500 W,料水比1∶35(m∶V),提取2次。微波处理时间分别取2,3,4,5,6 min。

(4)提取次数对多糖产率的影响:固定微波功率500 W,料水比1∶35(m∶V),微波处理时间4 min。分别提取1,2,3次。

1.3.4 响应曲面法试验设计 本试验在单因素试验结果的基础上,采用中心组合试验Box-Behnken设计方案,以微波功率、料水比及微波处理时间为自变量,虫草多糖得率为响应值,对虫草多糖的微波辅助提取工艺进行优化。

1.3.5 虫草多糖含量的测定 采用硫酸-苯酚法。标准曲线的制备:精密称取0.100 8 g于105℃下干燥至恒重的葡萄糖,置1 000 m L容量瓶中,加适量蒸馏水稀释至刻度,则质量浓度为0.100 8 mg/m L。再分别精密吸取5,10,15,20,25,30 m L于50 m L容量瓶中,定容至刻度,再分别吸取2.0 m L于6个比色管中;各加入6%苯酚溶液1.0 m L,混匀,迅速加入浓硫酸5.0 m L,混匀,沸水浴15 min后,冷却至室温,以蒸馏水为空白处理,于490 nm处测定吸光值[5],并绘制葡萄糖标准曲线(图1),得方程为y =7.957 1x-0.010 3,R2=0.998 4。

图1 葡萄糖的标准曲线方程Figure 1 The standard curve equation of glucose

1.3.6 虫草多糖产率的测定 虫草多糖产率按式(1)计算:

式中:

Y—— 虫草多糖产率,%;

C——吸光值对应的标准曲线上的葡萄糖浓度,mg/m L;

V——测定液的体积,m L;

f—— 稀释倍数;

W——试验所取的蛹虫草粉的质量,g。

2 结果与分析

2.1 中心组合试验设计方案及结果

根据单因素试验结果,确定微波辅助提取的次数为2,并且得出微波功率、料水比和微波处理时间的因素水平取值范围见表1。根据中心组合试验设计设计的方案及试验结果见表2。

表1 响应面分析试验因素与水平Table 1 Factors and levels in the response surface design

表2 Box-Behnken试验设计方案及结果Table 2 Box-Behnken design and results

2.2 模型的建立及显著性检验

利用 Design-Expert(version7.1.6)软件对表2的试验数据进行多元回归拟合,得到虫草多糖产率(Y)对微波功率、水料比、微波处理时间的二次多项回归模型为

Y =11.91+0.83A+0.7B+0.5C+0.02AB-1.31AC+0.06BC-1.15A2-0.83B2-0.56C2(2)

由表3可知,模型 P =0.000 2<0.01,表明 Quadratic回归方差模型是高度显著的;失拟项P=0.119 3>0.05,表明失拟不显著。模型的调整确定系数R2Adj=0.973 5,说明该模型能够解释97.35%的响应值变化。因此,该模型拟合程度良好,试验误差小,可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析和预测[6]。

2.3 响应面图分析及结果

2.3.1 微波功率与水料比对虫草多糖产率影响的响应面图

由图2可知,当微波处理时间固定为4 min时,微波功率和水料比的交互作用对多糖产率影响不显著(P=0.875 5)。从微波功率曲面斜率大于水料比曲面的斜率可知,微波功率对于虫草多糖产率的影响大于水料比对多糖产率的影响。当微波功率为500~550 W,料水比为1∶35~1∶38(m∶V)时,多糖的产率较高。

表3 二次回归模型的响应面方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

图2 微波功率与水料比交互作用的响应面图Figure 2 Response surface of microwave power and water to material ratio

2.3.2 微波功率和微波处理时间对虫草多糖产率影响的响应面图 由图3可知,当料水比固定为1∶35(m∶V)时,微波功率和处理时间交互作用的等高线呈椭圆形,说明二者交互作用极为显著。所以一定要控制好微波功率和提取时间,才能有较高的提取率。当微波功率为500~550 W,处理时间为3.5~4.5 min时,多糖的产率较高。

图3 微波功率与微波处理时间交互作用的响应面图Figure 3 Response surface of microwave power and microwave treatment time

2.3.3 水料比和微波处理时间对虫草多糖得率的影响 由图4可知,当微波功率固定为500 W时,水料比和微波处理时间的交互作用等高线图趋于圆形,则两者的交互作用不显著。当微波处理时间很小时,多糖得率普遍较低,这可能是时间短时,细胞的破壁效果不是很好,导致多糖的溶出率很低,相反,处理时间过长,多糖水解程度加大,导致多糖的得率下降,所以选择合适的处理时间也是至关重要的。综上述,当料水比在1∶36~1∶37.5(m∶V),处理时间在4.5 min左右时虫草多糖有较高的产率。

通过利用 Design Expert(version 7.1.6)软件以响应值(多糖的产率)进行优化分析,得到虫草多糖提取的最佳条件为微波功率533.8W,料水比1∶36.73(m∶V),微波处理时间4 min,在此条件下多糖的产率理论值为12.21%。为检验响应面分析法所得结果的可靠性,采用上述优化提取条件进行虫草多糖的提取,考虑到实际操作的便利,将提取工艺参数修正为微波功率534 W,料水比1∶37(m∶V),处理时间4 min,提取次数2次。在最佳工艺条件下进行5次平行实验,多糖得率平均值为12.10%,回归方程所得多糖得率预测值为12.21%,则两者之间产生的相对误差为0.9%,说明回归方程能较真实地反映各因素对虫草多糖得率的影响,也有力地说明了响应面法在提高虫草多糖产率方面回归模型较可靠。

图4 水料比和微波处理时间交互作用的响应面图Figure 4 Response surface of water to materials ratio and microwave treatment time

3 结论

采用响应面分析法研究了虫草多糖的微波辅助提取工艺,建立了虫草多糖产率的二次回归方程,经验证该模型极为显著,可用来预测响应值的变化,通过响应面分析得到优化后的最佳提取工艺条件为微波功率534 W、提取时间4 min、料水比1∶37(m∶V),提取次数2次,该条件下多糖提取率为12.10%,与传统的水热回流法提取虫草多糖的得率4.18%[2]来说大大提高了多糖的得率。

1 邓黎,周同永,韩涛,等.响应曲面法对蛹虫草多糖超声提取工艺的优化效果[J].贵州农业科学,2012,40(8):187~190.

2 王英娟,李多伟,王仪潮,等.蛹虫草虫草素、虫草多糖综合提取工艺研究[J].西北植物学报,2005,25(9):1 863~1 867.

3 马长雨,杨悦武.微波萃取在中药提取和分析中的应用 [J].中草药,2004,35(11):7~10.

4 单斌,张卫国,谢建华,等.响应面法优化超声辅助提取苦瓜多糖工艺的研究[J].食品与机械,2009,25(1):76~80.

5 刘玲,安家彦,金凤燮.蛹虫草多糖除杂蛋白的方法[J].大连轻工业学院学报,2002,21(1)33~37.

6 毕春慧,莲清.响应面分析法优化雷丸多糖提取工艺的研究[J].食品科技,2010,35(8):217~221.

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