酶解菌质水溶性膳食纤维表面显微结构及成分研究

余有贵 李忠海

YU You－gui 1 LI Zhong－hai 2

（1.邵阳学院，湖南 邵阳 422000；2.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004）

（1.Shaoyang University，Shaoyang，Hunan 422000，China；2.Central South University of Forestry Technology，Changsha，Hunan 410004，China）

膳食纤维是一种不能被人体消化的碳水化合物，具有预防肥胖症、增强免疫、防止糖尿病、预防结肠癌、抑制有害菌等作用［1－5］，被称为第七大营养素。根据它在水中的溶解特性分为水溶性膳食纤维（SDF）与不溶性膳食纤维（IDF）两种基本类型。SDF主要发挥代谢功能，影响碳水化合物和脂类的代谢，在预防糖尿病、心血管疾病，降低胆固醇和清除外源有害物质等方面具有比IDF更强的生理功能［6－9］。本研究在原有蕨渣膳食纤维资源开发、提取工艺优化的基础上［10－13］，进一步对酶解菌质水溶性膳食纤维的表面显微结构及组成成分进行研究，为其理化特性和生理功能的作用机理研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灵芝－蕨渣菌质粉：本实验室参照文献［11］制备；

α－淀粉酶：4 000 U／g，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；

木瓜蛋白酶：40万U／g，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；

纤维素酶：3 000 U／g，湖南尤特尔生化有限公司；

Dextran T－10、Dextran T－40、Dextran T－70、Dextran T－500：北京欣经科生物技术有限公司；

鼠李糠、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖和木糖：上海博奥生物科技有限公司。

1.2 主要仪器

水浴恒温振荡器：SHA－B型，江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；

气相色谱仪：GC－2010型，日本岛津公司；

高效液相色谱仪：waters600型，美国Waters公司；

扫描电子显微镜：Quanta－200型，荷兰Fei公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌质水溶性膳食纤维 称取一定量的灵芝－蕨渣菌质粉［11］，按料水比1∶4（m∶V）加入蒸馏水，用3 mol／L的NaOH溶液调节p H至6.0，加入质量分数0.5%的木瓜蛋白酶，在45℃水浴搅拌60 min；加入质量分数2.0%的α－淀粉酶，在68℃水浴搅拌45 min，去除菌质粉中的蛋白质和淀粉。取出水解醪冷却至50℃，用磷酸盐缓冲溶液调节p H至5.0，加入质量分数4.0%的纤维素酶，在50℃下水浴搅拌240 min。然后，煮沸灭酶，10 min。将酶的水解醪冷却至室温，离心（4 000 r／min，20 min）得到上清液，用4倍体积的95%乙醇沉淀、离心（4 000 r／min，5 min），取沉淀物在0.05 MPa下真空干燥2 h［13］，备用。

1.3.2 菌质SDF显微结构观察 样品用戊二醛固定，采用溅射镀膜法对固定后的菌质SDF样品进行表面镀金，将表面镀金的样品置于扫描电镜下观察［14］。

1.3.3 菌质SDF单糖组成测定 用气相色谱法进行单糖分析，采用氢火焰离子检测器（FID），以标准单糖衍生物的出峰时间来对菌质SDF样品进行定性。

（1）膳食纤维水解及单糖衍生化：采用完全酸水解法，称取0.2～0.5 g菌质水溶性膳食纤维于圆底烧瓶中，先用72%（m／m）的硫酸溶胀2 h，加水稀释至2 mol／L，置恒温水浴中100℃水解8 h，水解液用碳酸钡中和、过滤，滤液经冷冻干燥得到游离单糖。再称取干燥的单糖样品10 mg，加入0.5 m L吡啶、10 mg盐酸羟胺和1.5 mg肌醇内标，于烘箱中90℃保持30 min，取出冷却后再加入0.5 m L乙酸酐，放回烘箱中90℃保持30 min，待处理后的样品冷却后进行气相色谱（GC）分析。

（2）色谱条件：色谱柱为30 m×0.32 mm×0.25μm的OV 1701石英毛细管柱；FID检测器；气化室温度260℃；检测器温度250℃；程序升温：起始温度190℃保持3 min，以5℃／min的升温速率升至240℃，保持20 min；载气（N2）压力58.839 9 k Pa；燃气（H2）压力63.743 2 kPa；助燃气（空气）压力49.033 3 k Pa；分流比30∶1。

1.3.4 菌质SDF分子量分析

（1）样品制备：50 mg样品用蒸馏水完全溶解并定容至50 m L，摇匀后用0.45μm尼龙微孔膜过滤，取滤液进样，采用高效液相色谱（HPLC）法测定。

（2） 色 谱 条 件：色 谱 柱 为 Sugarpakl（6.5 mm×300 mm）；流动相为纯水；柱温85℃；流速0.5 m L／min；进样体积为10μL。

2 结果与分析

2.1 菌质SDF的显微结构

菌质SDF的表面显微结构见图1。菌质SDF表面有许多皱折，形成多孔的蜂窝状空腔和明显的裂缝，这表明酶的作用使得菌质水溶性膳食纤维的微观结构和分子大小发生了改变。同时，蜂窝状的结构增大了颗粒的表面积，从而有助于其提高水合性质，如果它与胆酸盐或其它物质和溶剂相接触时，便能形成更多的毛细管，且有更多的亲水基团和亲油基团暴露到表面，将具有更大的吸附容量［15－17］，这为其物理特性和生理功能提供了形态学方面的依据。

图1 菌质SDF的显微结构Figure 1 Microstructure of fungal substance soluble dietary fiber

2.2 菌质SDF的单糖组成

标准单糖衍生物的GC分析图谱见图2，各单糖组成见表1。菌质SDF样品经气相色谱仪分析的结果见图3，按照保留时间与单糖标样联合定性，内标法定量，确定菌质SDF水解后单糖组分的相对含量见表2。菌质水溶性膳食纤维主要单糖组分是葡萄糖，占总含量的92.452 8%，然后依次含有少量的甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖和木糖。木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖是组成半纤维素的主要单糖，葡萄糖是组成葡聚糖的主要单糖［17］。因此，初步推断菌质SDF的主要成分来源于葡聚糖、半纤维素。

图2 标准单糖糖腈乙酸衍生物的GC分析图谱Figure 2 The map of Acrylic acid derivatives of Standard monosaccharides by GC

表1 标准单糖的含量Table 1 The content of tandard monosaccharides

2.3 菌质SDF的分子量分布

以不同分子量标准右旋糖酐的分离保留时间（RT）与相应的分子量对数值（lg Mol Wt）绘制标准曲线见图4，R ＝0.999 6，试验结果表明，重均分子量的对数值与保留时间呈良好线性关系。

图3 菌质SDF样品水解后的GC分析图谱Figure 3 The map of hydrolysised samples of fungal substance soluble dietary fiber by GC

表2 菌质SDF样品酶解后单糖组分相对含量Table 2 The relative content of monosaccharide composition of hydrolysised samples of fungal substance soluble dietary fiber

图4 HPLC法测定相对分子量分布的标准曲线Figure 4 Standard curve of relative molecular weight distribution measured by HPLC

采用高效液相色谱分析菌质SDF分子量分布图谱见图5，菌质SDF的Mn（数均分子量）、Mw（重均分子量）、Mp（峰值分子量）的结果见表3。SDF根据分子量分为低聚SDF（120～620 Da）、中聚 SDF（1 800～16 000 Da）、多聚SDF（16 000～160 000 Da）［6］，而菌质SDF分子量分布主要有2个峰，重均分子量为1 772 Da的峰含量为68.75%、289 Da的峰含量为31.25%。表明纤维素酶的水解作用，破坏了菌质纤维多糖的糖苷键以及多糖链内、链外间的氢键作用力，使得纤维多糖发生降解，分子链被切断，分子量相对降低，导致聚合度下降，从而使菌质SDF成为低聚糖SDF。

重均分子质量（Mw）与数均分子质量（Mn）的比值为多糖摩尔质量多分散系数（d），其大小可以作为判断样品分子质量分布是否均一的指标［18］，d越大，说明分子量越分散；d＝1，说明分子量呈单分散缩聚产物；d＝2，为自由基产物；d＝3～5，说明存在支化。菌质SDF的1＜d＜2，说明通过酶水解制备的菌质SDF分子量呈单分散缩聚产物。

图5 菌质SDF的分子量分布图Figure 5 Mw distribution of fungal substance soluble dietary fiber

表3 菌质SDF分子量测定结果Table 3 The results of molecular weight of fungal substance soluble dietary fiber by HPLC

3 结论

（1）菌质SDF表面有许多皱折，形成多孔的蜂窝状空腔和明显的裂缝，比表面积大，为发挥物理特性和生理功能提供了形态学方面的依据。

（2）经复合酶对灵芝－蕨发酵的固体菌质进行水解、纯化，获得的菌质SDF的单糖组分为葡萄糖92.452 8%、甘露糖3.787 1%、阿拉伯糖1.545 6%、半乳糖1.313 2%和木糖0.901 3%。

（3）菌质SDF的相对分子量为1 772 Da占68.75%、289 Da占31.25%，说明菌质SDF为低聚糖SDF和呈单分散缩聚产物。

1 Brownlee Iain A.The physiological roles of dietary fibre［J］.Food Hydrocolloids，2011，25（2）：238～250.

2 Ajila C M，Leelavathi K，Prasada Rao U J S.Improvement of dietary fiber content and antioxidant properties in soft dough biscuits with the incorporation of mango peel powde［J］.Journal of Cereal Science，2008，48（2）：319～326.

3 Artissa b，Kathryn Broganc，Michelle Brucalc.Weight gain and selected blood parameters in rats［J］.Metabolism Clinical and Experimental，2006，55（12）：195～202.

4 Athanasios Papathanasopoulos，Michael Camilleri.Dietary fiber supplements：effects in obesity and metabolic syndrome and relationship to gastrointestinal functions［J］.Gastroen－terology，2010，138（1）：65～72.

5 王金亭.膳食纤维及其生理保健作用的研究进展［J］.现代生物医学进展，2007，7（9）：1 414～1 416.

6 刘凌，孙慧.桃渣可溶性膳食纤维组成及生理活性［J］.食品与发酵工业，2008，34（9）：69～72.

7 Kiyoshi Ebihara，Yoshihisa Nakamoto.Comparative effect of water－soluble and－insoluble dietary fiber on bowel function in rats fed a liquid elemental diet［J］.Nutrition Research，1998，18（5）：883～891.

8 Tosh S M，Yad A S.Dietary fibers in pulse seeds and fractions：Characterization，functional attributes，and applications［J］.Food Research International，2010，43（2）：450～460.

9 苗敬芝，冯金和，董玉玮.超声结合酶法提取生姜中水溶性膳食纤维及其功能性研究［J］.食品科学，2011，32（24）：120～125.

10 余有贵，李忠海，张亚，等.酶法提取蕨根膳食纤维的工艺优化［J］.食品与机械，2010，26（1）：129～132.

11 余有贵，李忠海，黄国华，等.响应面设计法优化蕨渣基质的灵芝培养条件［J］.中国生物工程杂志，2009，29（12）：37～42.

12 余有贵，李忠海，黄国华，等.灵芝发酵蕨渣基质生产菌质多糖的工艺优化［J］.中国食品学报，2010，10（5）：47～52.

13 余有贵，李忠海，黄国华，等.发酵法生产灵芝－蕨渣菌质水溶性膳食纤维的工艺优化［J］.食品科学，2011，32（5）：187～191.

14 Nandini C，Salimath P V.Structural features of arabinoxylans from sorghum having good rot－i making quality［J］.Food Chemistry，2001，74（6）：417～422.

15 景言，迟玉杰.豆渣水溶性膳食纤维酶法制备工艺及其品质分析［J］.食品与发酵工业，2012，38（8）：68～72.

16 钟希琼，胡文娥，林丽超.膳食纤维对油脂、胆固醇、胆酸钠和亚硝酸根离子吸附作用的研究［J］.食品工业科技，2010（5）：134～136.

17 陶颜娟，钱海峰，周惠明，等.纤维素酶法制备麦麸水溶性膳食纤维及其理化性质研究［J］.食品工业科技，2008，29（4）：127～130.

18 黄鹏，刘畅，王珏，等.沙棘水溶性膳食纤维的提取及结构分析［J］.食品科技，2011，36（2）：203～206，211.