超声波辅助提取山豆根中的黄酮和多糖工艺优化

赖红芳 黄秀香 陆俊宇

LAI Hong－fang HUANG Xiu－xiangLU Jun－yu

（河池学院化学与生命科学系，广西 河池 546300）

（Department of Chemistry and Life Science，Hechi University，Hechi，Guangxi 546300，China）

山豆根为豆科槐属植物越南槐 （Sophora tonkinensis Gapnep.）的干燥根及根茎［1］，别名广豆根、苦豆根、山大豆根（主要分布在广西地区石灰岩山地）。其味极苦、性寒、有毒，具有清热解毒、消肿利咽的功效，主治火毒蕴结、咽喉肿痛、齿龈肿痛等症［2］。山豆根的化学成分主要有生物碱、多糖、酚类、黄酮类等化合物［3］。其中黄酮类具有抗自由基能力［4］、抗炎作用［5］、抗肿瘤活性［6，7］等。而山豆根多糖具有体外清除活性氧自由基作用，也可能具有保护肝脏作用［8］。

目前，鲜见对山豆根黄酮和多糖的研究，其中关于黄酮的报道［9］只是研究了提取方法，而未进行工艺条件的优化；且多糖的提取［10］采用的是传统方法，提取率不高。超声波法是利用低频超声条件下对中药有效成分进行提取，并不改变药物成分，并具有省时，操作简单、快速等特点［11］。因此本研究拟采用超声波进行辅助提取，结合正交试验，分别对山豆根中的黄酮和多糖的提取工艺参数进行优化，为山豆根开发的工业化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

山豆根：购于宜州中药市场；

芦丁：UV≥98%，批号：20110825，上海源叶生物科技有限公司；

浓硫酸、苯酚、柠檬酸、磷酸氢二钠、无水乙醇、葡萄糖、氢氧化钠溶液、硝酸铝、亚硝酸钠等：均为市售分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

紫外分光光度计：UV－2102PCS型，尤尼科仪器有限公司；

电子分析天平：AE240S型，梅特勒－托利多仪器有限公司；

p H计：PHS－3B型，上海精密科学仪器有限公司；

循环水式多用真空泵：SHB－Ⅲ型，郑州长城科工贸易有限公司；

电热恒温水浴锅：SSY4型，北京泰克仪器有限公司；

超声波仪：JY92－Ⅱ型，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 山豆根的预处理 将烘干的山豆根粉碎后过20目筛，备用。取一部分用60%乙醇浸泡24 h进行脱脂。抽滤，在60℃恒温烘干24 h后，备用。

1.2.2 山豆根中黄酮成分的提取

（1）提取方法：准确称取山豆根粉末2 g，在一定料液比下加入一定浓度的乙醇提取剂，调节溶液p H，超声波处理一定时间，抽滤，置于100 m L容量瓶中，用30%乙醇稀释至刻度，得粗黄酮样品液，备用。

（2）芦丁标准曲线的制作：根据文献［12］，得芦丁质量浓度（mg／m L）与吸光度A 的关系方程为y＝14.346x＋0.002 2，r ＝0.999 7。

（3）山豆根黄酮含量的测定：准确吸取样品液2 m L，置于25 m L刻度试管中，按标准曲线制作的方法进行操作，在波长为510 nm下测定吸光度。并按回归方程计算样品溶液中黄酮的浓度。按式（1）求出样品中黄酮的含量。

式中：

R——黄酮含量，%；

C——由标准曲线求得的黄酮的浓度，mg／m L；

V1—— 稀释体积，m L；

V2—— 样品溶液的体积，m L；

M—— 样品质量，g；

V3—— 吸取样品溶液的体积，m L。

1.2.3 山豆根中多糖的提取

（1）提取方法：准确称取2 g脱脂后的山豆根粉末，在一定料液比、溶液p H、提取时间、提取次数的条件下提取，抽滤，合并滤液，转入250 m L容量瓶，定容。取2 m L上述溶液于50 m L容量瓶，定容，待测。

（2）葡萄糖标准曲线的制作：根据文献［13］，得回归方程：y ＝0.005 6x＋0.010 2，r＝0.999 2。

（3）换算因子的测定：根据文献［14］，制备山豆根粗多糖后，经过测定及计算得到换算因子为f＝5.3。

（4）多糖含量的测定：吸取2.0 m L样品液于25 m L比色管，按标准曲线方法进行显色测定吸光度，并按回归方程计算样品溶液中葡萄糖的浓度，按式（2）计算样品多糖含量。

式中：

Y——多糖提取率，%；

W——山豆根样品的质量，g；

C—— 多糖中葡萄糖的质量浓度，μg／m L；

D——山豆根多糖的稀释倍数；

f——换算因子。

2 结果与分析

2.1 山豆根中黄酮的提取工艺优化结果

2.1.1 正交试验结果与分析 通过前期单因素试验结果，对影响山豆根黄酮提取率的不同因素进行了初步的筛选，确定以溶液p H、乙醇用量、提取时间、乙醇的浓度为考察因素，并进行正交试验。以山豆根中黄酮含量为考察指标，采用四因素三水平L9（34）进行正交试验，试验因素水平见表1，结果见表2。

表1 L9（34）因素水平表Table 1 L9（34）factors level table

表2 正交试验结果与分析Table 2 Orthogonal test results

由表2可知，4个因素对山豆根黄酮提取率的影响顺序为A＞B＞D＞C，即料液比＞乙醇浓度＞提取时间＞p H值；根据极值大小确定山豆根黄酮的最佳提取工艺为A3B3C2D2，即料液比在1∶45（m∶V），乙醇浓度为100%，p H值为5，提取时间为70 min。

2.1.2 验证实验 准确称取5份山豆根粉末2 g，按最佳条件提取，得待测液，按1.2.2标准曲线操作测定，计算出黄酮含量及 RSD。黄酮含量分别为8.59，8.61，8.61，8.61，8.60 mg／g，平均含量为8.60 mg／g，RSD为0.1% （n ＝5），说明工艺精密度高。

2.1.3 加样回收试验 准确吸取最佳条件下提取的样品溶液2 m L于25 m L的比色皿中，平行5份，分别加入0.1 mg的芦丁标准溶液，按标准曲线显色，分别测其吸光度A值。根据回收率公式算出加样回收率，结果见表3。由表3可知，平均回收率为95.52%，说明符合加标回收的要求。因此，分析结果是准确的。

表3 黄酮加样回收率试验Table 3 Flavonoids plus sample recovery experiment

2.2 山豆根中多糖的提取工艺优化结果

2.2.1 正交试验 通过前期单因素试验结果，确定料液比、超声时间、提取p H、提取次数为主要影响因素，设计四因素三水平试验。试验方案设计及结果见表4和表5。

表4 正交试验因素水平表Table 4 Factor sand levels of orthogonal test

表5 正交试验结果与分析Table 5 Results of orthogonal experiment

由表5可知，提取次数对山豆根多糖的提取结果影响最大，提取时间次之，提取p H影响最小；其最佳的提取条件为A2B1C3D3，即料液比为1∶20（m∶V），提取时间为30 min，提取p H＝4.50，提取次数3次。

2.2.2 验证实验 在最佳工艺条件下，进行5次重复性试验，按1.2.3标准曲线测定并算出多糖含量及RSD。多糖提取率分别为6.06%，6.13%，6.06%，6.08%，6.07%，平均提取率为6.08%，RSD为2.83%（n＝5），说明该工艺稳定。

2.2.3 加样回收率试验 准确吸取已知含糖量的样品液5份，加入200μg葡萄糖，按标准曲线制作方法显色，测定吸光度，根据公式算出样品中多糖含量和加样回收率。由表6可知，回收率为91.2%，说明山豆根多糖测定方法可行。

表6 回收试验结果Table 6 Recovery experiment

3 结论

（1）超声波法提取山豆根黄酮最佳工艺。考察结果为将2 g山豆根粉末，在p H＝5时用90 m L无水乙醇超声提取70 min。在此条件下山豆根黄酮的得率为8.60 mg／g。

（2）超声波提取山豆根多糖的最佳工艺条件为料液比1∶30（m∶V），提取时间20 min，提取p H 4.50，提取次数3次。在此条件下山豆根多糖的提取率最高，为6.08%。

（3）利用超声波辅助法提取山豆根中黄酮并对其工艺进行优化，为其工业化生产提供思路，而且最佳工艺条件下的提取率远高于文献［9］中的提取率。而在对多糖提取中，试验结果比文献［10］的水提醇沉法提取率几乎提高1倍，大大提升了原料的利用率。同时超声波具有操作简单、快速、高效、污染低等特点，在工业化生产值得推广。

1 国家药典委员会.中国药典 （一部）［M］.北京：化学工业出版社，2005.

2 丁佩兰，郁韵秋，王钢力，等.RP－HPLC法评价山豆根药材质量［J］.复旦学报（医学版），2004，31（2）：208～210.

3 邓银华，徐康平，章为，等.山豆根化学成分研究［J］.天然产物研究与开发，2005，17（2）：172～174.

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5 窦金辉，李家实，阎文玫.山豆根生物碱成分的研究［J］.中国中药杂志，1989，14（5）：40～42.

6 宋明山，邢念增.槲皮素诱导TRAMP－C2细胞凋亡的实验研究［J］.临床泌尿外科杂志，2008，23（9）：708～711.

7 徐永中，范钰，姚广涛.槲皮素抑制胃癌BGC823细胞增殖的研究［J］.时珍国医国药，2008，19（8）：1 990～1 991.

8 胡庭俊，程富胜，陈炅然，等.山豆根多糖体外清除自由基作用的研究［J］.中兽医医药杂志，2004，23（5）：6～7.

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10 尹龙萍，邓毅，贾伟，等.山豆根粗多糖最优化提取工艺研究［J］.中药材，2007，30（3）：351～353.

11 赖红芳；黄秀香；韦瑞松.超声波法优化一点红多糖提取工艺［J］.食品科技，2012，37（1）：182～185.

12 李胜华，伍贤进，郁建平.超声波提取鱼腥草叶总黄酮优化工艺研究［J］.食品科学，2006，27（12）：207～273.

13 黄琼，丁玲.微波协同酶法提取金针菇多糖工艺的优化［J］.食品与机械，2013，29（1）：128～130.

14 黄秀香，覃玥，黄艳梅.半枝莲多糖提取工艺优化［J］.食品与机械，2013，29（2）：128～129.