唑来膦酸对胃癌细胞株SGC-7901体外抗增殖及对VEGF的影响

姚强，闵科，邓建良，许春妮，金俊

（江苏大学附属宜兴医院肿瘤科，江苏 宜兴 214200）

唑来膦酸对胃癌细胞株SGC-7901体外抗增殖及对VEGF的影响

姚强，闵科，邓建良，许春妮，金俊

（江苏大学附属宜兴医院肿瘤科，江苏 宜兴 214200）

目的研究唑来膦酸对胃癌细胞株SGC-7901的体外增殖抑制作用及对血管内皮生长因子(VEGF)的影响。方法采用CCK-8试验检测唑来膦酸对胃癌细胞株SGC-7901的生长抑制作用；酶联免疫吸附试验(ELISA)和半定量RT-PCR法检测药物对VEGF表达水平的变化。结果0.2～3.2μg/L的唑来膦酸能显著抑制SGC-7901细胞的增殖，且具有时间及剂量依赖性，不同药物浓度作用后，胃癌细胞株VEGF的蛋白及基因表达水平均明显降低(P＜005)，具有浓度依赖性。结论唑来膦酸能抑制胃癌细胞株SGC-7901的生长增殖，其作用机制可能为下调VEGF表达。

唑来膦酸；胃肿瘤；血管内皮生长因子

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一[1]，目前主要以手术、化疗及放疗为主要治疗手段。胃癌在早期就易发生侵袭及转移，如何提高患者的生存率及生活质量成为治疗关键。唑来膦酸(ZOL)是第三代双膦酸盐类药物，多个临床前研究显示ZOL具有一定的抗肿瘤作用[2-4]。本研究以人胃癌细胞株SGC-7901为研究对象，进一步探讨唑来膦酸的抑瘤机理。

1 材料与方法

1.1 材料胃癌细胞株SGC-7901由南京医科大学实验室提供，唑来膦酸(泽泰，瑞士诺华制药产品)RPIl640购自Hyclone公司，新生牛血清购自兰州民海生物工程有限公司，CCK-8试剂盒、VEGF酶免试剂盒购自上海锐赛生物有限公司，引物由美国Invitrogen公司合成。VEGF引物上游：5'-CCTGGTG-GACATCTTCCAGGAGTACC-3'，下游：5'-GGAGCT CATCTCTCCTATGTGCTGGC-3，扩增片段360 bp；β-actin引物上游：5'-AGAAGATGACCCAGATCATGTT-3'，下游：5'-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3'，扩增片段290 bp。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养细胞在含10%灭活新生小牛血清的RPMI-l640培养基(含0.1%的青、链霉素)中培养，生长至70%～80%融合时将细胞用0.25%胰酶消化后传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖抑制取对数生长期细胞，细胞浓度为5×104/ml加入96孔培养板中，每孔100μl，每组设5个复孔，并设空白对照组，12 h细胞贴壁后弃去培养基，分别加入终浓度为0.2μg/L、0.4μg/L、0.8μg/L、1.6μg/L、3.2μg/L的ZOL培养基，置于37℃、5%CO2饱和湿度温箱中继续培养24 h、48 h，每孔加入10μl CCK-8溶液，继续孵育4 h，用酶标仪450 nm测定每孔吸光度(A值)，记录结果；实验计算公式为：细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%，实验重复3次。

1.2.3 ELISA法检测VEGF水平常规培养细胞，取对数生长期细胞用于实验，浓度分别为0μg/L、0.2μg/L、0.4μg/L、0.8μg/L、1.6μg/L、3.2μg/L的ZOL培养基作用于胃癌细胞24 h，取离心后的细胞上清用于检测，预实验有选择性的稀释待测标本，计算各标本的VEGF值，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 半定量RT-PCR法检测VEGF-mRNA表达取对数生长期细胞用于实验，ZOL浓度为0μg/L、0.8μg/L、1.6μg/L的细胞培养基作用胃癌细胞48 h，以Trizol一步法提取总RNA，吸取4μl RNA样品，加水至1 ml，在紫外分光光度计上对RNA进行定量分析，确定RNA纯度。逆转录cDNA，扩增VEGF、β-actin(内参)。PCR反应体系：25μl反应体系，5× PCR Buffer 5μl，200μmol/L dNTPs 2.5μl，1.5 mmol/L Mg2+1.5μl，上下游引物浓度为0.2μmol/L，各0.5μl，Taq酶2 U(0.5μl)，双蒸水12.5μl，cDNA 2μl。VEGF反应条件：94℃5 min，94℃45 s，56℃30 s，72℃50 s，35个循环，72℃延伸10 min；β-actin反应条件：94℃5 min，94℃45 s，51℃30 s，72℃50 s，35个循环，72℃延伸10 min。取5μl反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶经Bio-RAD凝胶成像分析仪及GENE Tolls软件分析系统进行分析，测定各条带的灰度值，各组图像灰度值的均数与内参β-actin均数的比值即为VEGF-mRNA相对表达量。

1.3 统计学方法实验资料采用SPSS l7.0统计软件包分析，实验数据均采用均值±标准差()表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ZOL对胃癌细胞株的增殖抑制作用CCK-8实验结果显示，0.4μg/L的唑来膦酸在24 h及48 h的细胞相对增值率为(35±1.2)%和(58±2.3)%，0.8μg/L的唑来膦酸在24 h及48 h的细胞相对增值率为(40± 2.5)%和(70±1.9)%。结果表明，不同浓度唑来膦酸对胃癌细胞株SGC-7901均有明显的增殖抑制作用，且具有时间、剂量依赖性(P＜0.05)，见图1。

图1 ZOL对SGC-7901细胞增殖抑制作用

2.2 细胞上清VEGF水平变化结果显示ZOL作用于SCGC-7901细胞24 h后，随着药物浓度的增加，VEGF水平逐渐降低，唑来膦酸浓度为0.8μg/L时VEGF抑制率为42%，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图2。

图2 不同唑来膦酸浓度下VEGF水平变化

2.3 半定量RT-PCR法检测VEGF mRNA表达水平变化0μg/L、0.8μg/L、1.6μg/L的ZOL作用于胃癌细胞48 h后，进行半定量RT-PCR检测，实验成功扩增出相应PCR产物，各组图像灰度值数据为(0.81±0.08)、(0.42±0.07)、(0.23±0.05)，各实验组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见图3。

图3 半定量RT-PCR检测VEGF-mRNA表达水平

3 讨论

唑来膦酸是20世纪中期开发的一种骨吸收抑制剂药物，临床上主要用于治疗骨代谢障碍疾病，预防和治疗恶性肿瘤骨转移导致的一系列骨相关事件。近来大量的体内外试验证明唑来膦酸能直接抑制肿瘤细胞的增殖、分化、诱导细胞凋亡，降低肿瘤细胞的迁移、侵袭能力[5]。有关肺癌、乳腺癌、前列腺癌及肝癌等前期临床试验提示唑来膦酸与细胞毒药物、内分泌药物及靶向药物联合具有一定程度的协同抗肿瘤作用，并且在抗肿瘤药物之后序贯应用效果更好[6-7]。两个正在进行中的大型临床研究(SWOG)-S0307和NATAN旨在比较唑来膦酸与其他双磷酸盐类辅助治疗乳腺癌的作用以及比较唑来膦酸联合紫杉类化疗与单纯化疗治疗乳腺癌的疗效差异。该两项研究的结果将为唑来膦酸潜在抗肿瘤的作用提供新的依据[8-9]。

目前知道的最重要的血管调控因子是VEGF[10-11]。过去认为VEGF主要通过作用于间质的血管内皮细胞发挥作用，并对内皮细胞有促进有丝分裂和存活的作用。但最新的研究表明肿瘤细胞表面也有VEGF信号通路的调节，因此阻断VEGF信号传导通路可以从多个方面抑制肿瘤的生长。本研究提示唑来膦酸从蛋白及基因水平均可抑制胃癌细胞SGC-7901的VEGF表达。

综上所述，唑来膦酸作为第三代双膦酸盐类药物，不但能抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖，同时还抑制了VEGF的表达，值得进行进一步研究。

[1]Yokobori T,Mimori K,Iwatsuki M,et a1.p53 altered FBXW7 expression determines poor prognosis in gastric cancer cases[J].Cancer Res,2009,69∶3788-3794.

[2]Morgan G,Child J,Gregory W,et al.Effects of zoledronic acid versus clodronic acid on skeletal morbidity in patients with newly diagnosed multiple myeloma(MRC Myeloma IX)∶secondary outcomes from a randomised controlled trial[J].Lancet Oncol,2011,12(8)∶743-752.

[3]Ressler S,Mlineritsch B,Greil R.Zoledronic acid for adjuvant use in patients with breast cancer[J].Expert Rev Anticancer Ther, 2011,11(3)∶333-349.

[4]Pandya KJ,Gajra A,Warsi GM,et al.Multi-center,randomized, phase 2 study of zoledronic acid in combination with docetaxel and carboplatin in patients with unresectable stageⅢB or stage IV non-small cell lung cancer[J].Lung Cancer,2010,67(3)∶330-338.

[5]戴广海,吴志勇,石燕,等.伊班膦酸钠对人乳腺癌细胞系MDA-MA-23、MDA-MB-453的体外生长抑制作用[J].现代肿瘤医学,2007,15(6)∶744-747.

[6]Rack B,Juckstock J,Genss EM,et al.Effect of zoledronate on persisting isolated tumor cells in patients with early breast cancer[J]. Anticancer Res,2010,30(5)∶1807-1813.

[7]Mahtani R,Khan R,Jahanzeb M.The potential application of zoledronic acid as anticancer therapy in patient s with non-small-cell lung cancer[J].Clin Lung Cancer,2011,12(1)∶26-32.

[8]Duchesne G,Woo H,Howell D,et al.Tribulations of a prostate cancer trial-lessons learned from TOAD,a cancer council victoria and transtasman radiation oncology group trial[J].J Med Imaging Radiat Oncol,2010,54(5)∶508-511.

[9]Clinical Trials.gov.Postoperative use of zoledronic acid in breast cancer patient s after neoadjuvant chemotherapy(NATAN)[EB/ OL].Available at∶http∶//clinicalt rials.gov/ct2/show/NCT00512993 Accessed July 10,2010.

[10]Hatva E,Bohling T,Jaaskelainen J,et al.Vascular growth factors and receptors in capillary hemangioblastomas and hemangiopericytomas[J].Am J Pathol,1996,148∶763-775.

[11]Cornali E,Zietz C,Benelli R,et al.Vascular growth factor regulate angiogenesis and vascular permeability in Kaposi's sarcoma[J]. Am J Pathol,1996,149∶1851-1869.

Proliferation inhibition function of zoledronic acid on human gastric cancer cell SGC-7901 and its influence on VEGF.

YAO Qiang,MIN Ke,DENG Jian-liang,XU Chun-ni,JIN Jun.Department of Medical Oncology,the Yixing Hospital Affiliated to Jiangsu University,Yixing 214200,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo investigate the proliferation inhibition function of zoledronic acid on human gastric cancer cell SGC-7901 and its influence on vascular endothelial growth factor(VEGF).MethodsCCK-8 cell viability assay was performed to investigate the effect of zoledronic acid on cell proliferation.The expression of VEGF was examined by ELISA and semi-quantitative RT-PCR.ResultsZoledronic acid inhibited the proliferation of SGC-7901 cells at a dose-and-time dependent manner(concentration range∶0.2～3.2μg/L).Meanwhile,ELISA and semi-quantitative RT-PCR results showed that the expression of VEGF was down-regulated at a dose-dependent fashion in SGC-7901 cells.ConclusionZoledronic acid might inhibit the proliferation of SGC-7901 cells through down-regulation of VEGF.

Zoledronic acid;Gastric cancer;VEGF

R735.2

A

1003—6350（2014）19—2819—03

2014-01-13)

许春妮。E-mail：staff911@yxph.com

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2014.19.1111