Curcumin联合放射对人结肠癌细胞株HT29的增殖抑制作用研究

毛海姣，张小红，廖遇平，杨振，蒋艳君

（中南大学湘雅医院肿瘤科，湖南 长沙 410008）

Curcumin联合放射对人结肠癌细胞株HT29的增殖抑制作用研究

毛海姣，张小红，廖遇平，杨振，蒋艳君

（中南大学湘雅医院肿瘤科，湖南 长沙 410008）

目的探讨姜黄素(Curcumin,Cur)在放射线诱导的HT29细胞增殖及凋亡中的作用。方法常规培养HT29细胞，经6 Gy放射线照射和(或)Cur处理24 h后，通过MTT比色法分析空白对照组、6 Gy单独照射组及联合处理组(5μmol/L姜黄素+6 Gy组、10μmol/L姜黄素+6 Gy组、20μmol/L姜黄素+6 Gy组)HT29细胞增殖率,采用流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法分析细胞凋亡率，通过Elisa实验评价细胞中半胱氨酸蛋白酶Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9活性。结果Cur和6 Gy联合处理组的细胞增殖率明显高于空白对照组和6 Gy单独照射组(P＜0.05)，细胞凋亡率亦显著高于空白对照组和6 Gy单独照射组(P＜0.01)；同时，Cur和6 Gy联合处理组细胞中Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9活性亦明显高于对照组和6 Gy单独照射组(P＜0.05)。结论Cur可通过促进细胞凋亡相关因子活性，进而诱导HT29细胞凋亡，抑制其增殖，发挥HT29细胞对放射线的增敏作用，此可为结肠癌放射治疗的临床研究提供新的思路。

结肠癌；放疗；姜黄素；凋亡；半胱氨酸蛋白酶

姜黄素(Curcumin，Cur)是从姜科、天南星科中某些植物的根茎中提取的一种化学成分，姜黄素由两个邻甲基化的酚以及一个β-二酮组成，属于多酚类。姜黄素为橙黄色结晶粉末，不溶于水，随着环境酸碱条件的变化可呈现不同的颜色，在食品生产中可用于膨化食品、可可制品、人造黄油及碳酸饮料等产品的着色剂。除了具有传统作用外，大量医学临床研究表明姜黄素还具有广泛的药理作用，如抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗人类免疫缺陷病毒、抗肿瘤的功效，同时，对许多疾病还有预防作用[1]。最近发现，姜黄素在逆转肿瘤细胞的耐药性和增强肿瘤细胞在放射线敏感性方面也有出色表现[2-3]。

结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，好发于直肠与乙状结肠交界处，以40岁以上为多发年龄组，发病率在世界恶性肿瘤中排第三位。手术切除是治愈结直肠癌最好的手段，而术后辅助化疗能减少部分患者的复发和转移风险，进一步提高疗效，但放疗的疗效具有明显的剂量依赖性，且病灶部分周边正常组织对放疗耐受能力较差，一味增加放疗剂量会引起机体放射性损伤。因此，如何提高结肠癌的放疗敏感性，为患者进行规范化的辅助治疗，是每位临床医生面临的问题。本研究拟探讨姜黄素与放疗联用对人结肠癌HT29的增殖与凋亡的影响，并通过观察联合处理后细胞凋亡相关因子活力的变化，初步探讨二者联用的可能机制，为结肠癌的有效治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株和试剂人结肠细胞株HT29购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。胎牛血清和RPMI-1640培养基为Gibco公司产品(美国)。姜黄素和四甲基氮唑蓝粉末(Methyl thia zolyI tetra zolium，MTT)为美国Sigma公司生产。Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒由浙江联科生物技术有限提供。细胞裂解液(强型)、BCA蛋白浓度测定试剂盒和Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9活性检测试剂盒均购自碧云天生物技术研究所。其余试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养人结肠癌细胞HT29培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，置于37℃含5%CO2饱和湿度的培养箱中常规培养。每2 d传代一次，0.25%胰蛋白酶消化。

1.2.2 照射方法在常温下采用6MV-X线照射，照射视野10 cm×10 cm，剂量率40 cGy/min，源皮距为100 cm，均采用一次性照射至设定剂量。

1.2.3 MTT检测细胞增殖率取对数生长期的HT29细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，接种至96孔板中(每孔约5.0×103细胞/孔)，待细胞贴壁后进行实验处理。6MV-X照射剂量参照我们预实验结果及其他文献[4-5]报道确定为6 Gy。联合处理时，细胞随机分成五组，包括：①对照组(不加任何处理)；②6 Gy单独照射组；③5μmol/L姜黄素+6 Gy组；④10μmol/L姜黄素+6 Gy组；⑤20μmol/L姜黄素+6 Gy组。每组设6个复孔，24 h后每孔加入6 mg/ml的MTT 20μl，37℃孵育4 h，缓慢弃上清，加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，低速震荡10 min溶解结晶，酶标仪检测各孔在570 nm波长处的吸光度OD值，计算细胞增殖率。公式为：细胞增殖率(%)=[处理组OD值/对照组OD值× l00%]。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡水平取对数生长期的HT29细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，以5×104个细胞接种于6孔培养板，待细胞贴壁后进行实验处理。按1.2.3处理24 h后收集细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗两次，制备成浓度为4.0×106个/ml单细胞悬液，取80μl细胞悬液，加入320μl 1×Binding Buffer重悬细胞，再分别加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI溶液混匀，室温避光孵育20 min，流式细胞仪检测，Cellquest软件分析细胞凋亡百分比。

1.2.5 Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9活性水平检测取对数生长期的HT29细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，以5×104个细胞接种于6孔培养板，待细胞贴壁后进行实验处理。按1.2.3处理24 h后PBS清洗两次，收集细胞，制备单细胞悬液，调整细胞浓度至1.0×107个/ml，每107个细胞加入1 ml细胞裂解液，参照说明书方法分别提取总蛋白并测定蛋白浓度，将蛋白浓度调整一致后参照试剂盒方法测定Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9活性。

1.3 统计学方法所获数据均采用SPSS11.5版软件包进行统计学处理，实验数据以均数±标准差()表示，组间均数比较用方差齐性检验和t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖率检测结果MTT法分析6 Gy单独照射或联合姜黄素处理对HT29细胞增殖率的影响，如图1所示。实验结果表明，与对照组比较(100%)，所有处理组HT29细胞增殖率均被明显抑制[(76.2±1.8)%、(65.3±2.3)%、(62.1±3.7)%及(47.9± 5.1)%，F=36.9，P＜0.01)；同时，与6 Gy单纯照射组比较[(76.2±1.8)%]，各联合处理组随着姜黄素剂量的增加，HT29细胞增殖率随之显著降低，差异均有统计学意义[(65.3±2.3)%、(62.1±3.7)%及(47.9±5.1)%，F= 5.55，P＜0.05]。

图1 细胞增殖率(MTT)分析6 Gy联合不同浓度Cur处理24 h后HT29细胞增殖率的变化

2.2 细胞凋亡率检测结果6 Gy单独照射或联合姜黄素处理对HT29细胞凋亡率的影响，如图2所示。实验结果表明，所有处理组细胞凋亡水平均显著增加，与对照组[(3±0.41)%]比较差异有统计学意义[(25.3±1.8)%、(33.8±1.1)%、(39.2±1.5)%及(55.1± 3.2)%，F=112.3，P＜0.01]；同时，与6 Gy单独照射组比较(25.3%)，所有联合处理组中细胞凋亡率随姜黄素浓度的增加而显著升高[(33.8±1.1)%、(39.2±1.5)%及(55.1±3.2)%，F=99.6，P＜0.01]，呈明显姜黄素剂量依赖性。

图2 流式细胞术分析6 Gy联合Cur处理24 h后HT29细胞凋亡率的变化

2.3 凋亡相关半胱氨酸蛋白酶Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9活力检测结果6 Gy单独照射或联合姜黄素处理对HT29细胞中凋亡相关因子的影响，如图3所示。实验结果表明，与对照组比较[Caspase-3为(7.82±0.61)μmol pNA/109细胞；Caspase-6为(2.41±0.22)μmol pNA/109细胞；Caspase-9为(0.05±0.01)μmol pNA/109细胞]，所有处理组HT29细胞中三种半胱氨酸蛋白酶活力均显著升高，其中Caspase-3为(9.89±1.8)～(25.03±2.9)μmol pNA/109细胞，Caspase-6为(4.87±0.03)～(9.45±2.41)μmol pNA/109细胞，Caspase-9为(1.30±0.02)～(4.99±0.05)μmol pNA/109细胞(F=128.4，P＜0.01)；同时，与单独6 Gy组比较，所有联合处理组HT29细胞中三种半胱氨酸蛋白酶活力随姜黄素浓度的增加而随之显著升高(F= 24.1，P＜0.05)，呈明显姜黄素剂量依赖性。

图3 Elisa法分析6 Gy联合Cur处理24 h后HT29细胞中Caspase-3，Caspase-6，Caspase-9活力变化

3 讨论

放射增敏剂是一种化学或药物制剂，当与放疗同时应用时可以提高射线对肿瘤细胞的杀伤效应。理想的放射增敏剂必须具备以下特点：①不易和其他物质起反应、性质稳定；②有效剂量没有毒性或毒性较低；③针对肿瘤细胞有较强的放射增敏作用。使用放射增敏剂的最终目的是达到把正常组织并发症保持在能被接受的特定水平上，而又能提高肿瘤的治愈率[6]。

本研究以人结肠癌细胞株HT29为研究对象，检测姜黄素对6 Gy放射处理的细胞增殖和凋亡的影响，分析姜黄素作为放疗增敏剂治疗结肠癌的可行性。实验结果表明：6 Gy单独照射处理时对HT29细胞增殖率起到了一定的抑制作用，当6 Gy照射与5～20μmol/L的Cur联用处理时HT29细胞增殖率则明显低于6 Gy单独照射组。笔者通过流式细胞术细胞凋亡分析实验进一步证实了6 Gy与姜黄素联用时姜黄素表现出了显著的增敏作用。ELISA研究结果表明，5～20μmol/L的姜黄素与6 Gy联用时显著诱导了各联合组细胞中半胱氨酸蛋白酶Caspase-3、Caspase-6和Caspase-9的活性。因此，结合MTT和细胞凋亡结果，提示在本实验体系中姜黄素通过促进细胞凋亡率，降低了结肠癌细胞HT29的增殖率，符合放疗增敏剂筛选原则[7]，相关分子机制有待进一步研究。

综上所述，5～20μmol/L的姜黄素对人结肠癌细胞株HT29具有明显的放疗增敏作用，通过促进凋亡相关因子的表达而使细胞对射线诱导凋亡的敏感性提高，为今后结肠癌的放射治疗研究提供了一个新的治疗思路。

参考文献

[1]鲍华英,陈荣华.姜黄素的研究进展[J].国外医学∶儿科学分册, 2003,30(5)∶254-256.

[2]饶佳,黄仁魏.姜黄素抗肿瘤作用及机制的研究进展[J].新医学,2011,42(2)∶127-130.

[3]任金妹,纪宏宇,唐景玲,等.姜黄素抗肿瘤及逆转多药耐药的研究进展[J].中国药师,2013,16(10)∶1582-1585.

[4]张莉,邓守恒,李芳,等.姜黄素体外同步放疗对宫颈癌细胞增殖影响的实验研究[J].山西医药杂志,2013,42(4)∶369-371.

[5]李刚,种铁,王子明.姜黄素对人肾癌ACHN细胞放疗增敏作用的实验研究[J].现代泌尿外科杂志,2010,15(4)∶259-263.

[6]张均田.现代药理实验方法[M].2版.北京∶北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1998∶952-953..

[7]江曼,钱晓萍,刘宝瑞.恶性肿瘤放射增敏剂研究进展[J].现代肿瘤医学,2014,3(1)∶226-228.

Influence of curcumin combined with radiotherapy on the proliferation and apoptosis of HT29 cells.

MAO Hai-jiao,ZHANG Xiao-hong,LIAO Yu-ping,YANG Zhen,JIANG Yan-jun.Department of Oncology,Xiangya Hospital of Central South University,Changsha 410008,Hunan,CHINA

ObjectiveTo explore the effects of curcumin(Cur)on the proliferation and apoptosis of HT29 cells induced by radiotherapy.MethodsHT29 cells were routinely cultured and treated with 6 Gy and(or)Cur for 24 h∶control group,6 Gy singly used group,6 Gy combined with Cur group(5μmol/L Cur+6Gy,10μmol/L Cur+6Gy, 20μmol/L Cur+6Gy).Then MTT assay,flow cytometer,annexin V-FITC/PI double staining and elisa assay were performed to evaluate the proliferating ratio,apoptotic ratio and assess the Caspase-3,Caspase-6 and Caspase-9 activities in HT29 cells.ResultsThe cell proliferating ratio of HT29 cells in 6 Gy combined with Cur group was significantly decreased compared to the corresponding cells in either control or 6 Gy singly used groups(P＜0.05),and the apoptotic levels of HT29 cells were significantly increased compared to the corresponding cells in either control or 6 Gy singly used groups(P＜0.01).Simultaneously,the Caspase-3,Caspase-6 and Caspase-9 activities in the cells in 6 Gy combined with Cur group were increased compared to the corresponding cells in control and 6 Gy singly used groups(P＜0.05).ConclusionCur can increase the sensitivity of HT29 cells in response to 6 Gy through induction of apoptosis-associated factors and increasing apoptosis.Thus,our study may provide a new concern for the clinical treatment of colon carcinoma.

Colon carcinoma;Radiotherapy;Curcumin;Apoptosis;Cysteine protease

R735.3+5

A

1003—6350(2014)19—2816—04

2014-04-14)

毛海姣。E-mail：mhj.78@163.com

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2014.19.1110