超高效液相色谱串联质谱法测定人血浆中阿托伐他汀浓度

戴 立，吴晓莉，杨昌云，甘惠贞

（中国人民解放军第180医院药学科，福建 泉州 362000）

阿托伐他汀（atorvastatin，ATV）是具有选择性和竞争性的羟 甲戊二酰辅酶 A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，能降低总胆固醇、低密度脂蛋白和三酰甘油的血浆浓度，临床广泛用于治疗冠心病和血脂异常等疾病[1]。阿托伐他汀口服吸收迅速，且存在明显的首关效应，绝对生物利用度仅12%，大剂量服用后可能发生横纹肌溶解等不良反应[2]，临床使用过程中发现其在疗效及不良反应方面均存在个体差异，而此现象是否与阿托伐他汀的血药浓度之间存在联系，有待研究证实。为研究阿托伐他汀在人体的药动学过程及治疗药物监测的需要，本试验中建立了灵敏度较高的超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）法，用于测定阿托伐他汀血药浓度。

1 仪器与试药

Acquity UPLC H-class色谱系统、Xevo TQD质谱仪（Waters公司）；Heraeus Pico21离心机（美国赛默飞世尔科技公司）；AE240型双量程电分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；G560E型涡旋混合仪；pHS-3C型精密pH计（上海雷磁仪器厂）；HSC-12A型氮吹仪（天津恒奥科技发展有限公司）；CQX25-06型超声波清洗器（上海必能信超声有限公司）；微孔滤膜（0.22μm，美国津腾公司）。阿托伐他汀钙对照品（批号为23922106，LKT公司，含量99.2%）；黄体酮（批号为100027-200307，中国药品生物制品检定所）；乙腈、甲酸（Darmstadt Germany Merck KgaA）；甲醇、乙酸乙酯、冰乙酸、磷酸二氢钠、氢氧化钠均为分析纯（上海强顺化学试剂有限公司）；去离子水（自制）。

2 方法与结果

2.1 标准溶液配制

称取阿托伐他汀钙对照品0.8 mg，精密称定，用流动相溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成8μg/mL的对照品贮备液。另称取黄体酮对照品2 mg，精密称定，用流动相溶解并定容，配制成200 ng/mL的黄体酮内标溶液。将贮备液置4℃冰箱保存，备用。

2.2 检测条件

色谱条件:色谱柱为 AcquityUPLCBEHC18柱（50mm×2.1mm，1.7 μm，Waters公司），柱温 40 ℃ ，流动相为乙腈 -含 0.01% 甲酸的水溶液（70 ∶30），流速 0.3mL /min，进样量 10 μL。

质谱条件:采用电喷雾正电离源（ESI+），多反应离子监测模式（MRM），毛细管电离电压3.18 kV，锥孔电压16 V，脱溶剂气温度600℃，气流量1 000 L/h，碰撞气体为 Ar气，碰撞能量20 V，源温度150℃。

2.3 样品预处理

取正常人群体检剩余血液样品，经抗凝剂EDTA-2K作用下提取血浆，作为本试验的模拟血浆样品。取模拟血浆样品1 mL，加入内标贮备液 35μL、pH＝4.9的磷酸盐缓冲液 300μL、乙酸乙酯 3 mL，涡旋萃取 1.5 min，离心（4 000 r/min）3 min，取上层有机相于50℃水浴氮气挥干，残留物用500μL流动相涡旋溶解5min，离心（4 000 r/min）3min，经 0.22 μm 微孔滤膜过滤，进样10μL。

2.4 干扰试验

按2.2项下条件测定，质谱图见图1。阿托伐他汀与内标物质在各自离子通道上无内源性杂质干扰，色谱峰形良好，阿托伐他汀的保留时间约为0.63min，黄体酮的保留时间约为0.91min。

2.5 标准曲线与检测灵敏度试验

精密吸取阿托伐他汀对照品贮备液适量，以空白血浆为溶剂，配成质量浓度为 0.01，0.05，0.10，0.20，0.50，1.00，5.00，10.00，20.00，50.00 ng /mL 的系列含对照品的血浆样品。按 2.3项下方法处理后，以阿托伐他汀与内标物峰面积比值（R）对质量浓度（C）进行回归分析，得回归方程 R ＝0.160 7C+0.000 5，r＝0.998 9（n＝10）。另按同样方法配制 0.01 ng/mL 的标准含药血浆，按2.3项下方法处理后，用流动相反复稀释，依法测定，得最低检测质量浓度为 0.002 ng/mL（S /N≥3）。

图1 质谱图

2.6 萃取回收率试验

取空白血浆，加入适量的阿托伐他汀对照品贮备液，配成低、中、高（0.02，1.00，50.00 ng/mL）3 种质量浓度的标准含药血浆样品各5份。按2.3项下方法处理后分析，记录阿托伐他汀峰面积（A1）；另取空白血浆 1 mL，按 2.3项下处理，水浴、氮气挥干后，残余物用 0.02，1.00，50.00 ng /mL 3 种质量浓度的对照品溶液溶解，进样，记录阿托伐他汀峰面积（A2）。以 A1/A2计算萃取回收率。结果见表1。

表1 阿托伐他汀萃取回收率试验结果（n＝5，±s）

表1 阿托伐他汀萃取回收率试验结果（n＝5，±s）

质量浓度（n g/mL）0.0 2 1.0 5 0.0萃取回收率（%）7 6.5 ± 2.6 7 7 5.0 ± 1.8 1 7 3.2 ± 0.9 4 R S D（%）3.4 9 2.4 1 1.2 9

2.7 回收率和精密度试验

取阿托伐他汀对照品溶液及空白血浆，配成低、中、高（0.02，1.00，50.00 ng/mL）3 种质量浓度的标准含药血浆样品，各 5 份，以2.3项下方法处理，进样分析，所得结果代入线性回归方程计算得实测质量浓度，并与已知加入质量浓度相比，得方法回收率。同法配制3种质量浓度含药血浆样品，依法处理，于同日内5次、连续5日进样分析，考察精密度。结果见表2，方法回收率为95% ～106%，日内、日间精密度的 RSD均≤5%。

表2 阿托伐他汀回收率和精密度试验结果（n＝5，±s）

表2 阿托伐他汀回收率和精密度试验结果（n＝5，±s）

质量浓度（n g /mL）回收率（%） 精密度的 R S D（%）0.0 2 1.0 5 0.0±s 9 8.0 ± 4.4 7 9 9.3 ± 2.7 8 1 0 3.0 ± 2.9 4 R S D 4.5 6 2.1 4 2.6 5日内4.6 1 1.5 4 2.4 0日间4.5 6 3.9 0 3.7 1

2.8 样品稳定性试验

取空白血浆，加入适量阿托伐他汀对照品贮备液，配成质量浓度分别为 0.02，1.00，50 ng /mL 的低、中、高含药血浆样品各两份，分别于常温或-20℃反复冻融，按2.3项下方法处理后进样测定，共测定5 d，以第1天测得质量浓度为100%，考察稳定性。结果见表3。

表3 阿托伐他汀稳定性试验结果（n＝5，±s）

表3 阿托伐他汀稳定性试验结果（n＝5，±s）

条件相对含量(%)室温反复冻融质量浓度（n g /mL）0.0 2 1.0 0 5 0.0 0 0.0 2 1.0 0 5 0.0 0 1 d 1 0 0.0 1 0 0.0 1 0 0.0 1 0 0.0 1 0 0.0 1 0 0.0 2 d 1 0 0.0 9 9.5 9 6.4 1 0 0.0 9 8.8 9 9.8 3 d 9 0.0 9 2.7 9 6.0 1 0 0.0 9 8.2 9 8.9 4 d 9 0.0 9 1.7 9 3.2 1 0 0.0 9 7.8 9 8.4 5 d 8 5.0 8 7.0 9 2.5 9 4.5 9 3.5 9 7.8 R S D（%）7.2 1 5.9 9 4.2 8 3.5 2 2.4 1 1.3 3

3 讨论

目前阿托伐他汀血药浓度的测定方法有高效液相色谱-紫外分光光度（HPLC-UV）法[3]和高效液相色谱 -质谱（HPLCMS）法[4]。前者灵敏度较低，无法较灵敏地检测出阿托伐他汀消除相中的血药浓度。后者报道的最低检出质量浓度为0.25 ng/mL，本试验对其作适当改进，使血药浓度最低定量限达0.01 ng/mL，保留时间由4.16min缩短到1min以内，提高了分析准确度、灵敏度和分析效率。

本试验中采用液-液萃取的方法处理血样。在萃取剂的选择中，比较了环己烷、二氯甲烷、氯仿和环己烷-二氯甲烷（3.5∶1）对阿托伐他汀的萃取效果，结果显示，这些试剂虽可减少杂质干扰，但萃取回收率均低于35%；以正戊烷为萃取剂时，提取回收率较高，但样品容易乳化。以乙酸乙酯萃取，可显著减少杂质干扰，且两次萃取的回收率可达90%，比仅萃取1次的回收率提高约20%，由于一次萃取已可使生物样品的纯化和浓集满足分析要求，操作更便捷，故采取一次萃取。

阿托伐他汀的相对分子质量为557.71，而用质谱测得的质荷比是559.2，可能是在离子化过程中阿托伐他汀获得1个质子后所得离子化物质的质荷比。同理，黄体酮的相对分子质量是314.47，而检测到的黄体酮质荷比是315.5。

选择流动相时，比较了乙腈-甲醇-水[5]和乙腈 -含0.01%甲酸的水溶液（70∶30），结果前者的阿托伐他汀色谱峰有拖尾现象，且阿托伐他汀在乙腈中的稳定性比甲醇好，因此用乙腈为溶剂和流动相的成分。乙腈含量过高时，阿托伐他汀保留时间过短，且易受血中杂质干扰，适当降低乙腈的含量至70%使阿托伐他汀的保留时间在0.62 min时，药物及内标可与血浆中内源性物质达到基线分离。流动相中加入适当的甲酸，可增加阿托伐他汀的离子化效应，显著提高方法的灵敏度和分离效果。

以内标法定量可改善试验的准确度和精密度。文献[6]采用尼莫地平为内标，考虑到有可能受临床伍用该药而影响测定，故选用黄体酮为内标。在拟订的色谱条件下，黄体硐可与待测物适当分离，与待测物和内源性杂质在各自的离子通道上不会互相干扰，且1 min内可完成测定。黄体酮为人体内源性物质，在正常人群中的含量均小于0.002 ng/mL，占本试验中所加入内标含量的0.04%，对测定影响较小。

文献[7]报道，阿托伐他汀在人体内的有效血药浓度为0.25～25 ng/mL，而本试验所测得的血药浓度为 0.01～50 ng/mL，这为临床研究阿托伐他汀消除相的浓度范围时提供了良好的依据。

综上所述，文中拟订的方法准确、灵敏、稳定、简便，适用于阿托伐他汀血药浓度测定。

参考文献:

[1]Loe AP，MeTaviish D.Atorvastatin.A review of its pharmacology and therapeutic potential in the management of hyperlidaemias[J].Drugs，1997，53（3）:828.

[2]Malhotra HS，Cos KL.A Atorvastatin.An updated review of itspharmacologicalpropertiesand use in dyslipidaemia[J].Drugs，2001，61（12）:1 835.

[3]Bahrami G，Mohammadi B，Mirzaeei S，et al.Determination at atorvastatin in human serum by reversed-phase high-perpormation liquid chromatography with UV detection[J].JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2005，826（1-2）:41-45.

[4]Bullen WW，Miller RA，Hayes RN，et al.Development and validation of a high-perpormance liquid chromatography landem mass spectrometry assay for atorvastatin artho-hydroxy atorvastatin，para-hydroxy atorvastatin in human，dog，and rat plasma[J].J AM Soc Mass Spectrom，1999，10（1）:55-56.

[5]Erk N，Altuntas TG.Liquid chromatographic determination of atorvastatin in bulk drug，tablets，and human plasma[J].JLiq Chromatogr Relat Technol，2004，27（1）:83.

[6]刘 巍，张 庆.液相色谱-串联质谱法测定人血浆苯磺酸氨氯地平与阿托伐他汀钙浓度[J].医药导报，2010，29（6）:698-700.

[7]William W Bullen，Ronald A Miller，Roger N Hayes.Development and Validation of a High-Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Assay for Atorvastatin，Ortho-Hydroxy Atorvastatin，and Para-Hydroxy Atorvastatin in Human，Dog，and Rat Plasma[J].JAm Soc Mass Spectrom，1999，10:55-66.