急性B淋巴细胞白血病病儿miR－21表达及意义

刘秀琴，于树红，孙立荣

（青岛大学医学院附属医院儿科，山东 青岛 266003）

急性B淋巴细胞白血病（B－ALL）是儿童常见急性白血病，病死率高，严重威胁病儿生命，迄今为止，其发病机制仍不明确？microRNA（miRNA）为一类由20～25个核苷酸组成的内源性小分子非编码单链RNA，主要参与基因转录后水平表达的调控［1］，其表达失调在肿瘤的发生发展中起着关键的调控作用［2－5］。microRNA－21（miR－21）为重要的致癌基因，已有研究显示，miR－21在T淋巴细胞白血病和 NK 细胞 白 血 病 中 高 表 达［6－7］，miR－21高 表 达与前B细胞淋巴瘤的发病密切相关［8］。本研究用实时荧光定量PCR法，检测B－ALL病儿miR－21表达水平及其化疗前后变化，探讨其在儿童B－ALL发生、预后中的意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料

2006年10月—2010年10月，取青岛大学医学院附属医院儿科及青岛市市立医院小儿科初诊BALL病儿36例，男15例，女21例；年龄1～14岁，平均7.5岁；其中高危型13例，标危型23例。按细胞形态学、免疫表型、遗传学、分子生物学（MICM）诊断标准确诊，经流式细胞术检测均为B－ALL。病儿均给予长春新碱、柔红霉素、左旋门冬酰胺酶和强的松（VDLP）方案化疗，分别于化疗前及化疗后第2周末采集骨髓？临床2个疗程内完全缓解（CR）者为体内敏感；临床2个疗程不缓解者，骨髓白血病细胞下降指数（MBDI）≥60%为体内敏感，＜60%为体内耐药。MBDI＝（化疗前骨髓白血病细胞（%）－化疗后骨髓白血病细胞（%））／化疗前骨髓白血病细胞（%）×100%？以骨髓常规正常的非造血系统疾病病儿12例为对照组，近期未应用过糖皮质激素及其他免疫抑制剂，其中男8例，女4例；年龄1～12岁，平均6.5岁？

1.2 miR－21表达检测

1.2.1 骨髓单个核细胞（BMMCs）的分离 取骨髓5mL，EDTA抗凝，用生理盐水稀释3～4倍，然后将其缓慢加至Ficoll淋巴细胞分离液4mL中（相对密度1.077），以2 000r／min离心16min？取界面层得BMMCs，用生理盐水洗涤3次，以2×108／L的密度接种于含150g／L新生牛血清（Hyclone公司）的RPMI－1640培养液（美国GibcoBRL公司，内含有100kU／L青霉素和100kU／L链霉素）中，置37℃、体积分数0.05CO2和全湿条件下培养？

1.2.2 总RNA的提取及实时荧光定量PCR检测按Trizol（Invitrogen公司）试剂说明书提取细胞总RNA，为增加miRNA获得率，将异丙醇沉淀步骤改为－20℃沉淀2h以上。检测RNA溶液吸光度（A）值，A260／A280值＞1.8方可用于检测。加poly（A）尾后，应用M－MLV反转录酶（Invitrogen公司）进行逆转录反应，以Oligo（dT）为引物，反应条件如下：16℃30min，37 ℃ 30min，70 ℃ 10min，4 ℃10min。以制备的cDNA为模板，以U6作为内参，实时荧光定量PCR法在Roche定量PCR仪上进行扩增，miR－21 上 游 引 物 为：5′－AAAGTTGTAGTCAGACTATTCGAT－3′，下游引物为：5′－GCTGTCAACGATACGCTACGT－3′。所有样品做3个复孔，总反应体系20μL，设定反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，55℃退火5s，72℃延伸15s。按照文献［9］比较阈值法，读取Ct值，用公式2－△△Ct计算目的基因miR－21的表达水平。△△Ct＝（实验组 Ct目的基因－ 实验组 Ct管家基因）－ （对照组Ct目的基因－对照组Ct管家基因）。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，计量资料结果用表示，数据间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

化疗前B－ALL组miR－21表达水平高于对照组，差异有显著性（t＝20.75，P＜0.05）；B－ALL高危型组 miR－21表达水平为8.65±0.47，明显高于标危型组（5.23±0.35），差异有显著性（t＝23.23，P＜0.05）；化疗耐药组 miR－21表达水平明显高于化疗敏感组，差异有显著性（t＝10.12，P＜0.05）。化疗后B－ALL组、化疗敏感组miR－21表达水平较化疗前明显减低，差异有显著性（t′＝10.56，t＝13.57，P＜0.05）；化疗耐药组化疗前后 miR－21表达水平差异无显著性（P＞0.05）。见表1。

表1 各组miR－21表达水平比较（）

表1 各组miR－21表达水平比较（）

化疗前 化疗后对照组 12 2.85±0.98 B－ALL组 36 7.06±0.43 5.24±0.94化疗敏感组 30 6.69±0.49 4.59±0.61化疗耐药组组别 n 6 8.92±0.24 8.49±0.67

3 讨 论

白血病发病存在细胞增殖失控、分化障碍及凋亡抑制等生物学特点，造血细胞恶性增殖、凋亡受抑是白血病发病的主要病理学机制，并决定着白血病病儿的临床预后［10］？目前普遍认为，miRNA与肿瘤细胞的增殖密切相关，这其中尤以miR－21的研究较多。由于miR－21是目前公认的具有致癌作用的miRNA，在肿瘤的发生、发展过程中发挥枢纽调控效应。已有研究结果表明，miR－21的过度表达与白血病、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤和各种非血液系统实体肿瘤增殖、转移的能力和疾病预后有密切关系［6－8，11－15］；抑癌基因程序性细胞死亡因子4（PDCD4）可能是miR－21的靶基因，过表达的 miR－21能够抑制PDCD4表达，从而促进肿瘤细胞分化和增殖，并可诱导肿瘤细胞发生侵袭、血管浸润和转移［12－14］。进一步的研究结果显示，miR－21很可能是肿瘤耐药的关键因素，与肿瘤预后密切相关，反义抑制miR－21能够增加化疗药物对肿瘤细胞生长抑制［13］。其机制可能与 miR－21靶向作用PTEN，抑制P13K信号通路活化有关［16］。

本文研究结果显示，B－ALL病儿miR－21表达明显增高，其中高危型组miR－21表达明显高于标危型组，化疗后miR－21表达较化疗前降低，与文献结果相符，提示miR－21在儿童B－ALL的发病中发挥着重要的致癌基因作用。本文研究结果还显示，B－ALL病儿化疗后miR－21表达水平降低，以化疗敏感组最为明显，化疗耐药组miR－21表达化疗前后无明显改变；化疗耐药组化疗前miR－21表达显著高于化疗敏感组，提示miR－21过表达可能为儿童B－ALL的不良预后指标，与儿童B－ALL疾病预后有密切关系，miR－21过表达与儿童B－ALL白血病细胞增殖、转移能力以及疾病预后有密切关系，可作为儿童B－ALL预后判断指标。但具体的机制有待进一步探讨。

综上所述，miR－21通过对靶基因的调控调节细胞的分化、增殖和凋亡，其表达增高参与了肿瘤细胞的侵袭、血管浸润和转移，miR－21靶向药物可能成为治疗肿瘤的一种行之有效的方法，与抗肿瘤药物联合应用将是肿瘤治疗的一个新方向，也是提高疗效的关键。

［1］TURNER M L，SCHNORFEIL F M，BROCKER T.Micro－RNAs regulate dendritic cell differentiation and function［J］.Journal of Immunology，2011，187（8）：3911－3917.

［2］SAYED D，ABDELLATIF M.MicroRNAs in development and disease［J］.Physiological Reviews，2011，91（3）：827－887.

［3］LU J，GETZ G，MISKA E A，et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers［J］.Nature，2005（435）：834－838.

［4］ESQUELA－KERSCHER A，SLACK F J.Oncomirs－micro－RNAs with a role in Cancer［J］.Nature Reviews Cancer，2006（6）：259－269.

［5］ZHANG W Y，DAHLBERG J E，TAM W.MicroRNAs in tumorigenesis：aprimer［J］.The American Journal of Pathology，2007，171（3）：728－738.

［6］VAN DER FITS L，VAN KESTER M S，QIN Y J，et al.MicroRNA－21expression in CD4＋T cells is regulated by STAT3 and is pathologically involved in Sezary syndrome［J］.The Journal of Investigative Dermatology，2011，131（3）：762－768.

［7］YAMANAKA Y，TAGAWA H，TAKAHASHI N，et al.Aberrant overexpression of microRNAs activate AKT signaling via down－regulation of tumor suppressors in natural killercell lymphoma／leukemia［J］.Blood，2009，114（15）：3265－3275.

［8］MEDINA P P，NOLDE M，SLACK F J.OncomiR addiction in an in vivo model of micro RNA－21－induced pre－B－cell lym－phoma［J］.Nature，2010，467（7311）：86－90.

［9］SCHMITTGEN T D，LIVAK K J.Analyzing real－time PCR data by the comparative C（T）method［J］.Nature Protocols，2008，3（6）：1101－1108.

［10］SCHULER D，SZENDE B.Apoptosis in acute leukemia［J］.Leukemia Research，2004，28（7）：661－666.

［11］LÖFFLER D，BROCKE－HEIDRICH K，PFEIFER G，et al.Interleukin－6dependent survival of multiple myeloma cells involves the Stat3－mediated induction of microRNA－21through a highly conserved enhancer［J］.Blood，2007，110（4）：1330－1333.

［12］ASANGANI I A，RASHEED S A，NIKOLOVA D A，et al.MicroRNA－21（miR－21）post－transcriptionally downregulates tumor suppressor PDCD4and stimulates invasion，intravasation and metastasis in colorectal Cancer［J］.Oncogene，2008，27（15）：2128－2136.

［13］FRANKEL L B，CHRISTOFFERSEN N R，JACOBSEN A，et al.Programmed cell death 4（PDCD4）is an important functional target of the microRNA miR－21in breast cancer cells［J］.Journal of Biological Chemistry，2008，283（2）：1026－1033.

［14］LU Z，LIU M，STRIBINSKIS V，et al.MicroRNA－21promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4gene［J］.Oncogene，2008，27（31）：4373－4379.

［15］GU J Y，ZHU X J，LI Y M，et al.miRNA－21regulates arsenic－induced anti－leukemia activity in myelogenous cell lines［J］.Medical Oncology（Northwood，London，England），2011，28（1）：211－218.

［16］LEE J T JR，STEELMAN L S，MCCUBREY J A.Phosphatidylinositol 3’－kinase activation leads to multidrug resistance protein－1expression and subsequent chemoresistance in advanced prostate cancer cells［J］.Cancer Research，2004，64（22）：8397－8404.