影响PCR实验技术因素的分析与探讨

2014-04-29车立忱

中国动物保健 2014年1期

车立忱

摘要：本文根据笔者多年的PCR实验技术应用实践，对其影响因素进行了详细分析，从实验原理、反应体系组成与探讨，反应程序设计原则以及核酸提取等各步骤影响因素分别探讨，将各操作步骤注意事项进行阐述。

关键词：PCR实验技术；影响因素；分析与探讨

Abstract： According to the practical application of PCR technique to the author's many years， a detailed analysis of the influence factors， from the experimental principle， composition of the reaction system， reaction principles of program design and nucleic acid extraction， the influence factors were discussed. The operation steps precautions described.

Keywords：PCR experimental technique； influencing factors； analysis and discussion

PCR实验技术已广泛应用于生物界诸多领域，在微生物病原学检测中应用更为普遍，此技术对病原微生物的变异、溯源，起到了关键性作用，但在应用PCR进行病原分子生物学检测时，存在着诸多影响因素，笔者通过多年的PCR实验技术应用，现将影响因素分析如下。

1 PCR实验原理

从分子生物学相关知识了解到，双链DNA分子在临近沸点的温度下，加热时会分离成两条单链的DNA分子，每条单链DNA分子都会在DNA聚合酶的作用下，以单链DNA为模版，利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）合成新的DNA互补链。此外，DNA聚合酶同样需要有一小段双链DNA来启动新链的合成。实际上，新合成的DNA链的起点，是由加入在反应混合物中的一对寡聚核苷酸引物在模板两端的退火位点决定的。这是PCR技术的第一个特点，即能够指导特定DNA序列的合成。利用合成的特定引物与分离的单链DNA分子结合并延伸，生成两条新链，两条新链进而再与引物结合再合成新链，循环往复，以此类推，理论上PCR产物会以2n的方式大量扩增。这就是PCR技术的第二个特点。最后，经过琼脂糖电泳对扩增产物进行详细分析。

2 PCR反应体系成分

2.1 DNA聚合酶

常规的PCR每个反应（25～50 μL体系）大约需要0.5～2.5个单位Taq DNA，根据常规商品化制备的Taq DNA酶浓度计算，一个反应体系中大约含2×1012～10×1012个酶分子。而Taq DNA酶进行延伸的效率一般为0.7，因此当扩增产物在体系中达到1.4×1012～7×1012个分子时，酶分子几近枯竭，成为反应进行的一个重要的制约性因素。

2.2 引物

一个标准的PCR反应，每条引物的典型浓度是0.1～0.5 μmol/L，这个浓度对扩增1000 bp（碱基对）DNA的片段并少于30个循环的PCR是绰绰有余的。因为浓度过高会增加引物错配的几率，导致非特异的扩增，直接影响反应结果。

2.3 脱氧核苷三磷酸

一个PCR体系内应含有4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸dNTPs。如果扩增1000 bp长度的DNA片段，每种dNTPs浓度在20～200μmol/L即可，浓度过高可能会与Mg2+螯合而抑制反应，影响扩增结果。

2.4 二价阳离子

所有DNA聚合酶都要求有游离的二价阳离子，通常使用Mg2+。由于dNTP与寡核苷酸结合Mg2+，因而反应体系中阳离子的浓度必须超过dNTP和引物的浓度。适当增加镁离子浓度可减少非特异性扩增，通常的浓度为4.5 mmol/L，但也不是绝对，应根据不同的实验条件、实验要求，选择不同的模版，并经过反复多次试验予以验证。

2.5 缓冲液

一般使用商品化即可。

2.6 一价阳离子

一般包含在缓冲液内，无需另外添加。

2.7 模版DNA

理论上，体系内只要含有单拷贝的模版即可进行扩增反应，所以在进行PCR反应时模版使用量不用太多，太多的模板会影响新合成DNA产量。

3 PCR反应程序设计原则

3.1 变性

双链DNA的变性温度由G+C[胞嘧呤（G）和鸟嘌呤（C）]含量决定，G+C含量越高，完全分开DNA的熔解温度也越高。变性的时间是由DNA分子片段大小决定的，DNA分子越长，两条链完全分开所需的时间也越长。对于G+C含量为55%的线性DNA模版，94～95℃变性45 s即可。

3.2 退火

退火温度至关重要。温度过高，引物不能很好地与模板结合，扩增效率降低；温度过低，引物将产生非特异性结合，导致非特异性DNA片段的增加。一般在设计引物时，会有一个参考的退火温度，最科学的方法是利用梯度PCR实验技术进行试验，用实验结果确定最优的退火温度。

3.3 延伸

在最适温度下（一般72℃），Taq DNA聚合酶的聚合速度约为2000 bp/min，根据多年经验一般扩增1000 bp片段，延伸时间可设计为1 min。

3.4 循环数

PCR扩增所需循环数取决于反应体系中起始的模版拷贝数以及引物延伸和扩增效率。一旦PCR反应进入几何级数增长期，反应会一直持续下去，直至某一成分成为制约因素。扩增产物中绝大多数应该是特异性的扩增产物，而非特异性的扩增产物应该是降低到难以检测出来的程度。

4 核酸提取

核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时应遵循以下原则：保证核酸分子一级结构的完整性；排除其它分子污染。

核酸必须从细胞或其它生物物质中释放出来。细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。核酸的高电荷磷酸骨架结构，决定了核酸比蛋白质、多糖、脂肪等其它生物大分子物质更具亲水性，根据组织中各种成分的理化性质不同，来分离组织中的各种多余成分，利用选择性沉淀等方法可以将核酸进行分离与纯化。利用氯仿可去除脂肪，使更多蛋白质变性，从而提高提取效率。裂解后离心，疏水性的蛋白质被分配至有机相，核酸则被留于上层水相。吸取上层水相再加入异丙醇可使核酸浓缩形成沉淀，经离心收集核酸沉淀，再用75%的乙醇漂洗以除去多余的盐分，即可获得纯化的核酸。

5 核酸提取注意事项

5.1 避免污染。

一是避免样品对操作人员感染；二是避免操作人员对样品污染；三是避免样品间的交叉污染，如果出现样品污染，可能出现假阳性结果。

5.2 细心操作提高核酸产率。

核酸容易断裂，稍有不慎就会出现核酸断裂或流失，从而产生核酸产量过低或没有产量，可能出现假阴性结果。

5.3 在提取RNA时，注意控制RNA酶的活性。

玻璃器皿、操作人员的手上以及毛发、被污染的试剂均有可能存在RNA酶，必须小心、谨慎操作避免RNA酶将核酸降解。

5.4 序列的反应体系中进行30个循环就可以收到理想的效果，时间过长，实验效率将降低。

6 PCR实验技术注意事项

6.1 防止反应体系被痕量DNA模板污染。解决办法如下：

6.1.1 在装有紫外灯的工作台内加PCR试剂，凡不用工作台时应打开紫外灯。工作台内始终放置PCR专用的微量离心机、一次性手套、整套移液器和其它必需品。所有缓冲液、吸头和离心管使用前必须经高压处理。

6.1.2 进入PCR配液区，应戴上一副新手套并勤于更换。