低温胁迫下椰子叶片解剖结构差异研究

曹红星 黄汉驹 雷新涛 张大鹏 张如莲

摘 要 以2年生的海南本地高种椰子和香水椰子2个椰子品种的幼苗为材料，根据温度的日变化规律，设置4个不同的最低温度处理，分别为CK（自然温度处理）、16 ℃（T1处理）、12 ℃（T2处理）、8 ℃（T3处理），处理20 d后，对其植株的寒害症状及组织解剖结构变化进行研究。结果表明，随着处理温度的降低，叶片受伤害情况越来越严重，叶片结构越来越不规则，尤其在T3处理下香水椰子的叶片结构严重变形。叶片总厚度在不同低温处理下变化明显，可作为椰子抗寒种质鉴定时的结构指标，海南本地高种抗寒性比香水椰子强。

关键词 椰子；低温处理；解剖结构

中图分类号 S667.4 文献标识码 A

椰子为棕榈科椰子属的喜温树种，是典型的热带木本油料作物和食品能源作物，在高温和阳光充足的条件下生长发育良好。椰子要求年平均温度在24～25 ℃以上，才能正常开花结果，一年中若有1个月的平均温度为18 ℃，其产量则明显下降，若平均温度低于15 ℃，就会引起落花、落果和叶片变黄[1]。因此，低温是影响椰子生长发育的重要限制因子，若椰子抗寒育种取得突破性进展，对提高其在低温季节的产量、扩大种植范围和面积，推动椰子产业的发展具有重要意义[2]。已有研究结果表明，低温下叶片解剖结构的变化与抗寒性关系密切，通过研究野生欧洲李秋季和春季叶片解剖结构的差异发现，栅/海比（栅栏组织厚度/海绵组织厚度）和组织结构紧密度（CTR）与野生欧洲李的抗寒性显著相关[3]；通过对14个早实核桃品种的抗寒性进行综合评价表明，叶片厚度、气孔密度和栅/海比是影响抗寒性的主要叶片组织结构指标[4]；有的研究认为抗寒性较强的植物在低温处理过程中，栅栏细胞层数目多，叶脉密度较高[5]。植物叶片解剖结构鉴定已成为评价植物抗寒性的重要方法，并应用于不同种质抗寒性鉴定的研究中[6-10]。因此，开展椰子叶片解剖结构的研究对椰子抗寒种质材料的筛选具有重要意义。

在椰子解剖结构研究方面，对不同椰子品种的1年生幼苗叶片进行解剖观察和比较，初步推测4个品种的抗寒能力依次为本地高种（绿）、本地高种（褐）、马来亚红矮、马来亚黄矮[11]。通过对5个椰子品种成年植株叶片解剖结构进行研究发现，叶片的栅栏组织厚度和叶片厚度可以作为抗寒指标，在供试品种中，抗寒性最强的是海南本地高种，抗寒性最弱的文椰4号（香水椰子）。但是关于低温对椰子解剖结构变化影响的研究还少见报道。本研究通过对2个椰子品种在低温处理下叶片解剖结构的变化特性，筛选出与抗寒密切相关的结构指标和抗寒种质，为抗寒种质资源的早期筛选鉴定和抗寒品种的培育提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试2个品种分别为海南本地高种椰子和香水椰子，取自海南省文昌市中国热带农业科学院椰子研究所育苗基地，选取生长健壮，长势一致，无病害的2年生的盆栽苗。

1.2 方法

1.2.1 低温胁迫处理 实验于2013年1月6～26日进行，2个椰子品种分别选取生长一致的盆栽苗在植物光照培养箱中（型号：RXZ-280B）进行低温胁迫，以自然环境温度为CK（温度范围18～22 ℃），根据自然条件下温度的日变化进行模拟，设置不同的最低温度处理：T1（16 ℃）、T2（12 ℃）、T3（8 ℃）（表1）。各处理结束后，以顶端下第2～3片叶定为样品叶进行石蜡切片，同时观察植株出现的寒害症状，每处理3株，重复3次。

1.2.2 叶片解剖结构的测定 取顶端以下第3片叶，从叶片中部切取，避开中部较大的叶脉，切成5 mm×3 mm小片，经过材料固定、酒精梯度脱水（各20 min）、透明、浸蜡、包埋、按8～10 μm厚度切片、展片、番红-固绿染色、中性树胶封片、光学显微镜照相。制片后在Leica DM2500光学显微镜下物镜40倍观察拍照，用目镜测微尺测量叶片厚度、上表皮厚度、上角质层厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、下表皮厚度、下角质层厚度，并分别计算细胞紧密度（CTR）、疏松度（SR）。每个温度处理观察3个切片，每个切片取10个视野测定平均值。

1.3 数据分析

利用Excel软件对原始数据进行统计，然后采用SPSS软件，对测定的解剖结构指标数据进行方差分析和Duncan多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫下植株的寒害表现

分别对2年生椰子在不同低温胁迫下植株的寒害情况进行观察。发现海南本地高种椰子在自然生长条件下（CK），椰子幼苗均生长正常，无萎蔫脱水的现象出现。随着处理温度的降低，植株受伤害情况逐渐加重。但是香水椰子在CK处理过程中，有轻度受害的现象出现，第17天开始出现叶片萎缩的现象，可能与实验处理期间外界环境温度较低（CK处理的最低温度18 ℃），香水椰子的抗寒性较差有关（表2）。

在T1处理下，海南本地高种椰子的叶片第5天出现萎缩，而萎缩一直持续到第17天才出现了轻度的折叠，第20天叶片才有紧缩的现象；香水椰子的叶片第5天出现萎缩，第13天萎蔫，第16天叶片紧缩，第20天叶片折叠收紧。

在T2处理下，海南本地高种椰子和香水椰子都是第5天出现萎缩现象，海南本地高种椰子第16天才出现轻度的折叠，第20天叶片折叠收紧现象较为明显，而香水椰子第10天出现萎蔫，第20天出现水渍状。

在T3处理下，海南本地高种椰子还是第5天出现萎缩现象，第14天轻度折叠，第20天严重折叠；香水椰子第3天就出现萎缩现象，第16天就出现水渍状，受害严重，第20天叶片全部变褐，严重失水。

2.2 低温胁迫下叶片的解剖结构形态比较

对2个不同椰子品种在低温处理下椰子解剖结构变化的显微观察发现，CK处理下的栅栏组织和海绵组织排列规则，但随着温度的下降，细胞间隙越来越大，排列越来越不规则；海绵组织边缘规则，随着处理温度的降低，胞间隙扩大，边缘越来越不规则。

由图1可以看出，海南本地高种椰子的叶片细胞结构紧密程度远高于香水椰子，在CK处理下，海南本地高种椰子的栅栏组织和海绵组织排列非常整齐﹑有规则，在T2和T3处理下，依然能保持着相对紧凑完整的叶片形态，只不过T3处理下海绵组织和栅栏组织的分界已经开始模糊不清；而香水椰子细胞结构在CK处理下，细胞结构排列不如海南本地高种椰子排列紧密，T2和T3处理下疏散，趋于破碎，尤其T3处理下，海绵组织和栅栏组织已不能区分，由此可知，海南本地高种椰子的叶片组织结构比香水椰子更耐受低温寒害影响，T3处理可能温度较低对实验结果的观察有一定的影响。

2.3 低温胁迫下叶片组织解剖结构指标比较分析

海南本地高种椰子叶片组织解剖结构指标在不同低温处理下的变化见表3，随着处理温度的降低，叶片总厚度都比CK有所降低，T1、T2、T3处理的叶片厚度与CK相比，分别减少了2.92%、17.96%、13.05%，CK和T2、T3处理分别达到显著差异水平，但T3处理的反而比T2处理的高；栅栏组织厚度和叶片总厚度表现出相类似的变化趋势；海绵组织厚度在不同低温处理下变化不大，仅有T2处理和另外3个处理达到显著差异的水平；组织紧密度（CTR）在不同温度处理下比较稳定，各处理之间都未达到显著差异的水平；组织疏松度（SR）在不同低温处理下变化不大，仅CK和T3处理达到显著差异的水平；栅栏组织与海绵组织比（P/I）在不同温度处理下也表现比较稳定，各处理间都未达到显著差异的水平。

香水椰子的叶片总厚度，随着处理温度的降低，叶片总厚度都比CK有所降低，T1、T2、T3处理的叶片厚度与CK相比，分别减少了23.50%、25.10%、6.47%，但CK和T3处理的叶片总厚度显著高于T1和T2处理；栅栏组织厚度也表现出和叶片总厚度相类似的变化特征，T1、T2、T3处理的栅栏组织厚度与CK相比，分别减少了26.18%、27.07%、3.32%，CK和T3处理的栅栏组织厚度也显著高于T1和T2处理；海绵组织厚度在低温处理过程中变化差异较大，T1、T2、T3处理的叶片厚度与CK相比，分别减少了43.15%、33.33%、19.86%，CK和T1、T2、T3处理分别达到显著差异的水平；组织紧密度（CTR）在不同温度处理下变化不大，各处理间都未达到显著差异的水平；组织疏松度（SR）在CK处理下值最高，和其他处理都达到显著差异的水平，T1处理的值最低，T2和T3处理差别不大，未达到显著差异的水平；栅栏组织与海绵组织比（P/I）在不同温度处理下也表现比较稳定，仅CK和T1处理间达到显著差异的水平。

从以上研究结果可知，2个品种椰子的叶片总厚度、栅栏组织厚度和海绵组织厚度都表现为和CK相比，T1和T2处理都较CK有较大幅度的下降，但T3处理反而比T1或T2处理的值有所上升，可能在T3处理下，叶片的结构发生变形，细胞扭曲，细胞间隙加大，尤其是海绵组织和栅栏组织的分界已经开始模糊不清有关，而且栅栏组织厚度和海绵组织厚度的变化不明显，可能不宜作为低温处理研究椰子解剖结构的变化。CTR和P/I的值相对比较稳定，SR值的变化相对较大。

3 讨论与结论

研究不同低温处理下植物耐寒相关指标的变化是研究植物抗寒能力、评价植物抗寒性的重要方法。通过研究布迪椰子、沼地棕和油棕3种棕榈植物在低温锻炼前（10月份）和低温锻炼后（次年1月份）所采的叶片在不同低温处理时的电解质渗透率变化趋势不同，发现布迪椰子的耐寒力最强而且对降温反应速度最快，沼地棕居中，油棕耐寒力最弱，对温度反应最慢[12]；以伊丽莎白和玉金香2个甜瓜品种为材料，以正常自然温度（25 ℃/18 ℃，12 h）为对照，研究了昼夜低温（10 ℃/5 ℃，12 h）和夜间低温（20 ℃/5 ℃，12 h）处理对甜瓜幼苗生长及根系生理指标的影响，结果表明，与对照相比，昼夜低温和夜间低温处理7 d均显著抑制了甜瓜幼苗生长，玉金香比伊丽莎白对低温更加敏感[13]；以杜竹属清甜竹、花吊丝竹和勃氏甜龙竹的盆栽苗为实验材料，测定了模拟低温（0、-5、-10、-15、-20和-25 ℃和自然低温（15、10、5、3、0和-2 ℃）条件下3个竹种叶片的形态变化以及相对电导率等抗寒相关指标的变化，认为3个竹种的抗寒性均较差，其中清甜竹的耐寒能力最弱[14]。本研究也是通过抗寒相关指标在低温处理下的变化，评价不同椰子品种的抗寒能力，与上述的研究方法相类似。

而叶片形态解剖结构的变化是植物对低温等环境适应的基础，其结构的稳定性与其抗寒能力密切相关[15-16]。在本研究中，在T1、T2处理下，和CK相比，海南本地高种椰子和香水椰子的叶片总厚度、海绵组织厚度、栅栏组织厚度都有所降低，但是仅有叶片总厚度在不同低温处理下，差异表现较为明显，可作为抗寒性的评价指标，而栅栏组织厚度、海绵组织厚度在不同温度处理下变化幅度不如叶片总厚度大，尤其是海南本地高种椰子的栅栏组织厚度和海绵组织厚度在不同处理下变化差异不明显，不宜作为抗寒评价的指标；上述3个指标的香水椰子降低的幅度比海南本地高种椰子的大，可能与香水椰子在低温处理下结构变形较为明显，抗寒性不如海南本地高种椰子强，这与以前的研究结果相类似[14-15]。但在T3处理下，叶片总厚度、海绵组织厚度、栅栏组织厚度等反而比T2处理下有所增加，尤其是香水椰子增加的幅度较大，可能与T3处理的温度太低，植株萎蔫直至严重脱水，细胞结构变形，栅栏组织与海绵组织难以准确的区分有关[17-18]。

在利用叶片解剖结构评价植物的抗寒性时，单一的叶片结构参数受环境影响大，不能反映植物的抗寒能力，所以通常采用叶片细胞结构紧密度（CTR）和疏松度（SR）作为评价抗寒能力的指标，通过对一些植物叶片组织解剖结构的研究发现，品种的抗寒性与叶片组织结构紧密度呈正相关，与组织疏松度呈负相关[19-21]。但有的研究认为SR和CTR等指标与抗寒性关系不大[22-24]，本研究中也得出类似的结果，CTR、SR和P/I的值在低温处理的过程中变化幅度较小，不宜作为抗寒评价的指标。

通过对2个椰子品种叶片解剖结构在低温处理下的变化研究，认为叶片总厚度在2个椰子品种的不同低温处理下都变化明显，可作为椰子抗寒种质鉴定时的结构指标进行运用。香水椰子在CK处理下（最低温度18 ℃），有轻度受害的现象出现；T1（最低温度16 ℃）和T2（最低温度12 ℃）对其伤害比较大，叶片变褐﹑结构变形，叶片总厚度等结构指标的值降低幅度较大；T3（最低温度8 ℃）处理下受到严重胁迫伤害，结构严重变形，海绵组织和栅栏组织混淆，叶片总厚度等结构指标的数值反而有所上升。而海南本地高种椰子在CK处理下生长正常，T1处理对其结构变化影响不大，T2和T3处理下仍能保持相对完整的叶片形态，叶片总厚度等结构指标在每个处理下的变化幅度小于香水椰子结构指标的变化幅度，表明海南本地高种椰子的抗寒性强于香水椰子。

参考文献

[1] 毛祖舜， 邱维美. 椰子丰产栽培技术[M]. 海口： 海南出版社， 三环出版社， 2006.

[2] 赵松林， 曹红星. 椰子种质资源的收集、 保存、 鉴定评价及创新利用[M]. 北京： 中国农业出版社， 2012.

[3] 赵 蕾. 野生欧洲李抗寒特性研究[D]. 乌鲁木齐： 新疆农业大学， 2009.

[4] 刘杜玲， 张博勇， 彭少兵， 等. 基于早实核桃不同品种叶片组织结构的抗寒性划分[J]. 果树学报， 2012， 29（2）： 51-57.

[5] Dumlao M R， Darehshouri A C， Christopher M. Low temperature acclimation of photosynthetic capacity and leaf morphology in the context of phloem loading type[J]. Photosynthesis Research， 2012， 113（1-3）： 181-189.

[6] 何小勇， 柳新红， 袁德义， 等. 不同种源翅荚木的抗寒性[J]. 林业科学， 2007， 43（4）： 24-30.

[7] 李 剑， 余有本， 周天山， 等. 陕西茶树品种的抗寒性研究[J].西北农业学报， 2009， 18（1）： 262-266.

[8] 田景花， 王红霞， 高 仪， 等.核桃属4树种展叶期抗寒性鉴定[J]. 园艺学报， 2012， 39（12）： 2 439-2 446.

[9] 刘艳萍， 朱延林， 康向阳， 等. 不同类型广玉兰的抗寒性评价[J]. 林业科学， 2013， 49（6）： 178-183.

[10] Schreiber S G， Hamann A， Hacke U G， et al. Sixteen years of winter stress： an assessment of cold hardiness， growth performance and survival of hybrid poplar clones at a boreal planting site[J]. Plant， Cell and Environment， 2013， 36（2）： 419-428.

[11] 刘 蕊. 不同椰子叶片解剖结构的观察[J]. 西南农业学报， 2011， 24（4）： 1 425-1 429.

[12] 阮志平， 向 平， 李振基. 布迪椰子、 沼地棕和油棕的耐寒性研究[J]. 北京林业大学学报， 2008， 30（4）： 77-81.

[13] 李 琦， 别之龙， 牛蒙亮， 等. 不同低温处理对甜瓜幼苗生长和根系生理特性的影响[J]. 长江蔬菜， 2011（24）： 25-29.

[14] 李迎春， 陈双林， 郭子武， 等. 模拟低温或自然低温条件下牡竹属3种类抗寒性及生理指标的比较[J]. 植物资源与环境学报， 2012， 21（3）： 13-19.

[15] 刘 蕊， 范海阔， 张 军. 5个椰子品种植株叶片解剖结构的观察[J]. 热带作物学报， 2013， 34（4）： 690-694.

[16] 房 用， 孟振农， 李秀芬， 等. 山东茶树叶片解剖结构分析[J]. 茶叶科学， 2004， 24 （3）： 190-196.

[17] 王 玉， 洪永聪， 丁兆堂， 等. 利用茶树叶片解剖结构指数预测茶树种质材料的抗寒性[J]. 中国农学通报， 2009， 25（9）： 126-130.

[18] 黄丽云， 范海阔， 周焕起， 等. 2008年海南省椰子寒害调查[J]. 中国果树， 2009（2）： 66-68.

[19] 曹红星， 宋唯一， 孙程旭， 等. 应用电导率法及Logistic方程测试椰子幼苗耐寒性研究[J]. 广西植物， 2009， 29（3）： 510-513.

[20] 彭伟秀， 杨建民， 张 芹， 等. 不同抗寒性的杏品种叶片组织结构比较[J]. 河北林果研究， 2001， 16（2）： 145-147.

[21] 常红伟. 延边地区不同梨品种解剖结构与抗寒性的研究[D]. 长春： 东北师范大学， 2008.

[22] 阮志平. 引种棕榈植物的耐寒适应性机制研究[D]. 厦门： 厦门大学， 2008.

[23] 李国华， 徐 涛， 陈国云， 等. 10个品种澳洲坚果叶片解剖学的比较研究[J]. 热带作物学报， 2009， 30（10）： 1 437-1 441.

[24] 梁李宏， 梅 新， 林 锋. 低温胁迫对腰果幼苗叶片组织结构和生理指标的影响[J]. 生态环境学报， 2009， 18（1）： 317-321.