原生质体融合法选育酵母菌株酿造低甲醇高总酯蒸馏酒

林小江　周世水

摘要 [目的]选育酿造低甲醇高总酯蒸馏酒的酿酒酵母菌株。[方法]利用原生质体融合技术，对低甲醇酿酒酵母与高总酯酿酒酵母进行融合。[结果]选育出的酵母菌种酿造蒸馏酒中的相对甲醇含量为145.31 mg/L，比初始低甲醇菌株降低了22.8%，总酯含量为0.79 g/L，增加了83.7%。[结论] 原生质体融合法成功选育出低甲醇高总酯的酿酒酵母菌株。

关键词 原生质体融合；蒸馏酒；甲醇；总酯

中图分类号 S609.9；TS261.1；TS262.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）13-04050-01

Abstract [Objective] Screening Saccharomyces cerevisiae of brewing distilled liquor with low methanol and high total esters. [Method] Technology of protoplast fusion was used to fusing Saccharomyces cerevisiae of low methanol and Saccharomyces cerevisiae of high total esters. [Result] The methanol was 145.31 mg/L in the distilled liquor fermented by protoplast fusion， decreasing 22.8% than strain of low methanol. The total ester was 0.79 g/L， increasing 83.7%. [Conclusion] The Saccharomyces cerevisiae of low methanol and high total esters was obtained by technology of protoplast fusion.

Key words Protoplast fusion； Distilled liquor； Methanol； Total esters

酿造酒中都含有一定浓度的甲醇，其中约50%甲醇来源于发酵原料中的果胶质、纤维素经水解产生，另外50%甲醇来源于酵母代谢甘氨酸生成[1]。由于甲醇对人体来说是一种有害物质，因此，国标对酒中甲醇有严格的规定，如以粮食为原料酿造的蒸馏酒中相对甲醇含量（按酒精度60%vol计算）不得超过400 mg/L，薯干类原料的蒸馏酒中不得超过1 200 mg/L[2]。

酯是中国白酒香味的主要来源之一，其含量和种类直接影响到白酒的品质，且受到酿酒酵母、生香酵母等微生物发酵的影响。因此，笔者采用原生质体融合技术[3-4]筛选出1株既能提高总酯、又降低甲醇的酵母融合菌株，应用到酿酒上不仅能提高酒的安全性和口感品质，而且简化生产操作，将具有很好的开发前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种。低甲醇酿酒酵母、高酯香酵母，华南理工大学生物学院选育保藏。

1.1.2 培养基。液体培养基（YPD）：葡萄糖20 g/L、酵母膏10 g/L、蛋白胨10 g/L；固体完全培养基（CM）：YPD中添加15 g/L琼脂；固体高渗完全培养基（HCM）： CM中添加170 g/L蔗糖。

1.1.3 主要仪器。气相色谱仪：安捷伦 7890A 气相色谱仪；气相色谱柱：DBFFAP毛细管柱（30 m×0.53 m×1.00 μm），进样器：安捷伦 7694E 顶空进样器。

1.2 原生质体融合菌株的制备

1.2.1 原生质体的制备。将低甲醇酵母和浓香酵母单倍体接种至YPD液体培养基中，28 ℃、150 r/min振荡培养12～16 h。调节酵母浓度至107cfu/ml，取1 ml于1.5 ml离心管中，3 000 r/min离心10 min收集菌体，用HPBS洗涤离心2次，加入1 ml HPBS，预处理剂0.05 mol/L EDTA 2.5 ml、0.5 mol/L β巯基乙醇 0.2 ml，35 ℃预处理30 min，3 000 r/min离心5 min，用HPBS洗涤离心2次，再加入0.3 g/L蜗牛酶溶液1.0 ml，35 ℃水浴30 min。3 000 r/min离心10 min后再用HPBS洗涤离心2次，悬浮于HPBS中保存，并分别涂布到HCM平板和CM平板，28 ℃培养，若HCM上长出菌落而CM上无，表明已制备好原生质体[5-6]。

1.2.2 原生质体融合。分别取106 cfu/ml的低甲醇酵母原生质体、浓香酵母原生质体的菌悬液4 ml到培养皿中，30 W紫外灯20 cm处照射70 s，吸取1.0 ml菌悬液60 ℃保温14 min。再分别取0.5 ml到5 ml离心管，加1.0 ml促融剂，32 ℃保温40 min，4 000 r/min离心10 min，用HPBS洗涤离心2次，取0.1 ml涂布于HCM上，28 ℃培养3～5 d[7]。

1.2.3 融合菌株的发酵。挑取平板上长出的多个菌落接种于10 ml 12°P麦汁培养基中，23 ℃静置发酵7 d，用2株出始菌株发酵做对照，蒸馏后测定酒中甲醇、总酯含量。

1.3 皂化回流法测定总酯 吸取25.0 ml酒样到250 ml三角瓶，加25 ml水、2滴酚酞指示剂，用0.1 mol/L NaOH标准溶液滴定至微红色，测定总酸；再加入5.0 ml 0.1 mol/L NaOH标准溶液，沸水浴中回流皂化0.5 h，冷却后转到250 ml碘量瓶，立即用0.1 mol/L HCl标准溶液滴定至微红色刚好消失，计算酒中总酯：

X=C×（V0-V1）×88/25。

式中，X为酒中总酯的质量浓度（g/L），C为HCl标准溶液的实际浓度（mol/L），V0为空白对照样品消耗HCl标准溶液的体积（ml），V1为样品消耗HCl标准溶液的体积（ml），88为乙酸乙酯的摩尔质量（g/mol），25为吸取样品体积（ml）。

1.4 甲醇的顶空色谱测定

1.4.1 色谱分离条件。N2流速1.0 ml/min，干燥空气流速350 ml/min，H2流速30 ml/min，压力72.8 112 kPa，分流比50∶1，检测器温度250 ℃，汽化室温度150 ℃，进样量1 μl。采用程序升温：先35 ℃保温4 min，再以20 ℃/ min升温到180 ℃，并保温5 min。

1.4.2 顶空进样条件。顶空瓶温度80 ℃，平衡时间5 min，定量环温度85 ℃，气体填充时间0.5 min，平衡时间0.1 min，气体传输线温度90 ℃，样品瓶压力平衡0.2 min，进样时间1 min，振荡幅度为1。

1.4.3 样品的制备。9 ml的发酵蒸馏酒与1 ml的内标溶液（3 g/L的乙酸丁酯）混合成样品，酒精度为40%vol。

2 结果与分析

2.1 原生质体的确认

按“1.2.1”方法制备好双亲的原生质体，并分别涂布接种于HCM平板和CM平板上，28 ℃下倒置培养3 d，在HCM上有菌落生长，而在CM上无菌落长出，这说明已制得原生质体。

2.2 融合子的筛选

按“1.2.2”方法进行双亲原生质体的融合，并涂布在HCM板上培养，28 ℃下倒置培养3 d后长出菌落，可初步判定这些菌落为融合菌株。因为经紫外照射70 s的低甲醇酵母原生质体和经60 ℃热处理的浓香酵母原生质体都已经失活而不能长出菌落。再挑取多个菌落进行发酵，以复筛融合子，融合子进行发酵分析的试验数据见表1。

3 结论与讨论

利用原生质体融合技术成功选育出1株低甲醇高总酯的融合菌株，与初始低甲醇酵母菌株发酵蒸馏酒的相对甲醇含量188.21 mg/L相比，其相对甲醇含量为145.31 mg/L，降低22.8%；发酵酒中总酯含量为0.79 g/L，比初始低甲醇酵母菌株的总酯含量（0.43 g/L）升高83.7%，仅比初始高酯香酵母菌株的总酯含量（0.91 g/L）略微降低。

通过对比发现，融合菌株1、10酿造酒的相对甲醇含量都明显降低，最低达到139.54 g/L，这表明原生质体融合技术选育菌株在降低甲醇上是有效的。但对于融合菌株酿造酒的总酯虽然比初始低甲醇酵母菌株的0.43 g/L都显著提高，但是低于初始高酯香菌株的0.91 g/L，效果不明显。因此，利用原生质体融合技术选育菌种是可行的，对于不同代谢途径及其代谢产物的育种效果存在一定差异，分析产生差异的原因还需要进一步研究。

参考文献

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[2] 贺瑞凤.蒸馏酒及配制酒中甲醇测定方法的探讨[J].中国卫生检验杂志，2010，11（12）：3242-3244.

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