腺病毒介导的HGF转染骨髓间充质干细胞影响移植颗粒脂肪新生血管形成的初步研究

王有虎 刘毅

[摘要]目的：研究腺病毒介导的肝细胞生长因子（HGF）转染骨髓间充质干细胞对移植颗粒脂肪新生血管形成的影响。方法：分离培养雄性大鼠MSCs，用Ad-GFP、Ad-HGF转染MSCs，流式细胞仪测定转染效率。Wistar雌性大鼠150只，随机分为5组：A组 颗粒脂肪+0.4mlDMEM-LG；B组 颗粒脂肪+0.4ml DMEM-LG+1×108pfuAd-HGF液；C组 颗粒脂肪+0.4mlDMEM-LG+1×106MSC ；D组颗粒脂肪+0.4ml DMEM-LG+1×106 MSC（携带GFP基因）；E组颗粒脂肪+0.4mlDME-LG +1×106 MSC（携带HGF基因），均匀震动5min，移植于背部皮肤与肌肉之间。3、5、7、14、28、60天取移植的颗粒脂肪组织，HE染色观察病理变化，用免疫组化法检测移植体CD34表达，观察新生血管生成。结果：MOI=100时，Ad-GFP转染MSCs效率达86.4%，Ad-HGF转染MSCs，ELISA检测HGF分泌量在48h表达量最高。E组移植体新生血管7天左右达高峰，14天后趋于平稳，在5、7、14、28、60天血管数量多于其他组（P<0.05）。结论：携带有HGF基因骨髓间充干细胞有效的能促进移植颗粒脂肪的血管形成。

[关键词]肝细胞生长因子；骨髓间充质干细胞；颗粒脂肪移植；血管形成；基因转染

[中图分类号]R62 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）15-1260-04

Experimental study of transplanted mesenchymal stem cells transfected with adenoviral ventor mediated HGF gene enhance angiogenesis of grain fat grafts

WANG You-hu1，LIU Yi2

（1.Department of Otorhionolaryngology，Nead and Neck Surgery，The First Hospital Lanzhou University，Lanzhou 730000，Gansu，China；2.PLA Center of Plastic Surgery，Lanzhou General Hospital of Lanzhou Command， Lanzhou 730050，Gansu，China）

Abstract： Objective To investigate the angiogenetic effect of transplanting mesenchyma stem cells （MSCs） transfected with HGF gene on fat grafts. Methods MSCs of male Wistar rats were collected and cultured in vitro，and were transfected with Ad - GFP or Ad-HGF.The transfection infectivity of Ad - GFP to MSCs was assayed by fluorescent microsopy and flow cytometry.150rats were randomly divided into 5groups： control group （group A，30rats），MSCs group （group B，30 rats），Ad-HGF group （group C， 30rats），MSCs transplanted with Ad-GFP group（groupD，30rats）， MSCs transplanted with Ad-HGF group（groupE， 30 rats）.Then free fat tissue from inguinal region，mixed with MSCs，Ad-HGF，MSCs transplanted with Ad-GFP and MSCs transplanted with Ad-HGF respective，were transplanted to rats back， but control group were only mixed with DMEM-LG. fat grafts were obtained on day 3，5，7，14，28，60 implantation，The expression of CD34 in fat grafts were detected by immunohistochemistry. Results Transfection efficiency was correlated with the multiplicity of infection （MOI）and a highest transfection efficiency （86.4）could be achieved at MOI of 100.MSC expressed HGF at a high level after being transfected with the Ad-HGF for 48h .The HGF expression could maintain for at least two weeks.Microvesselquantity in group E was much more than that in other group （P<0.05）.at post-transplantation day 5，7，14，28，60. Conclusion MSCs transfected with Ad-HGF can express continuous HGF and promote angiogenesis in grain fat grafts.

Key words：HGF；MSC；Fat grafts transplant；angiogenesis；gene transfection

Traktueue等[1]预测脂肪移植将来在修复组织缺损中将扮演重要的角色，但是颗粒脂肪移植后存在最大问题是移植脂肪因缺血、缺氧后液化坏死，易被吸收或形成囊肿、纤维化，从而影响远期效果。因此，脂肪移植要取得进一步的进展，就要深入研究脂肪移植后的再血管化[2-3]。

骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类重要的干细胞，可跨胚层分化为各类细胞。其容易分离和培养扩增，同时具有可移植性，易于外源基因转染和表达，是基因治疗理想的载体细胞。肝细胞生长因子（ hepatic growth factor，HGF）是一种多功能的细胞因子，其生物学活性通过单一受体c-Met（c-met protoncogene product） 介导，引起细胞内一系列信号转导途径的级联激活，从而调节细胞的增殖、分化、运动和血管生成等。基于此，我们用腺病毒为载体，把HGF基因导入骨髓间充质干细胞，然后与颗粒脂肪混合移植，充分发挥MSCs多项分化潜能和HGF强大的血管效应，旨在为颗粒脂肪移植建立新生血管诱导生物组织工程模式。

1 材料和方法

1.1实验材料：Ad-GFP（携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒）和Ad-HGF（携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒），兰州军区兰州总医院哈小琴老师惠赠；Percoll试剂（Amersham Pharmacia Biotech公司）；兔抗人CD34多克隆抗体及SP试剂盒（武汉博士德生物工程公司）；DMEM-LG培养基（Gibco公司）；OLYMPUS XT70型荧光倒置显微镜（OLYMPUS公司，日本）；流式细胞仪（BD公司，美国）；Imge-Pro Plus 图像分析软件（Version 4.1）（美国Media Cybernetics公司）。

1.2MSCs的分离、培养与扩增：应用Percoll（1.073g/ml）密度梯度离心法从健康雄性Wistar大鼠（体重120g）的骨髓中分离得到单核细胞，接种于含10%胎牛血清的DMEM-LG培养液中，置于37℃、5%CO2 条件下培养，72h后换液。原代培养6d左右形成细胞克隆，约10天形成贴壁细胞层。胰蛋白酶消化后传代扩增，第3～5代用于实验。

1.3重组腺病毒介导GFP基因/HGF基因转染MSCs：将细胞以1×106 接种于6孔板，贴壁后，弃去培养上清，加入含不同感染强度的Ad-GFP病毒颗粒的DMEM-LG培养基（0、25、50、100、200pfu/ cell）孵育2h，换含5%血清的培养基继续培养48h检测荧光。转染48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光强度并用流式细胞仪检测转染效率。Ad-HGF感染采用Ad-GFP转染率最高的病毒强度。

1.4实验动物分组处理及指标检测

1.4.1实验动物分组处理：150只雌性Wistar大鼠（兰州军区兰州总医院动物实验科提、供）随机分为：空白对照组（A组 n=30）、Ad-HGF组（B组 n=30）MSC组（C组n=30）、Ad-GFP感染MSC组（D组 n=30）、Ad-HGF感染MSC组（E组 n=30）。用3%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（40mg/kg）取腹股沟区脂肪1ml，均匀剪成小块，用生理盐水冲洗。A组 颗粒脂肪1ml+0.4mlDMEM-LG；B组 颗粒脂肪1ml+0.4ml DMEM-LG+1х108pfuAd-HGF液；C组颗粒脂肪1ml+0.4mlDMEM-LG+1×106MSC；D组颗粒脂肪1ml+0.4ml DMEM-LG+1×106MSC（携带GFP基因）；E组颗粒脂肪1ml+0.4mlDME-LG+1×106MSC（携带HGF基因）均匀震动5min，用注射器接12号针头注射于背部的皮肤与肌肉之间。3、5、7、14、28、60天每次各组取5只脱颈处死，并沿被膜分离出移植物，标本用10%富尔马林固定，规制成石蜡切片， HE染色进行组织病理学观察。

1.4.2 血管染色和血管计数方法：按照免疫组化SP法操作步骤进行，工作液浓度为1：150。每张切片分别在周边区和中央区各选3个高倍（×4OO）视野，每个视野中进行微血管计数，然后求其均值。凡是染成棕色单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为1个血管计数。

1.5统计学分析：所有数据采用SPSS11.5统计学软件进行处理，数据用均数±标准差（x±s）表示， 并进行单因素方差分析和多个样本均数之间的多重比较，P<0.05 差异有统计学意义。

2 结果

2.1MSCs 的体外培养：从骨髓中分离获取的单个核细胞培养24h后逐渐出现贴壁细胞，换液逐渐除去未贴壁细胞，培养4天可见似分裂中的成纤维样细胞，6天可见多个细胞克隆形成似，12～14天细胞形态不一、多呈梭形，90%以上融合。传代细胞于24h内贴壁，10～12天融合。

2.2GFP基因/HGF基因在MSC中的高表达：Ad-GFP转染对数生长期MSCs 48h后在荧光显微镜下观察，在低倍的视野下呈“满天星”状，在高倍视野发绿色荧光的MSC，呈不规则形，有些细胞的轮廓清晰可见，有些融合成片（如图1）。当MOI=100时，用FCM检测GFP表达率89.6%，感染效率最高，说明重组腺病毒能够有效的感染MSC。ELISA检测HGF分泌量结果显示，感染MSC后HGF基因可在短期内高效表达，48h表达量最高（如图2）。

2.3 移植颗粒脂肪组织的病理学变化：所有移植体均被纤维被膜包裹。移植后5、7天，E组有大量的血管长入移植物（如图3）。镜下，早期脂肪移植物内及周围有单核细胞、淋巴细胞、浆细胞及中性粒细胞浸润，其中A、B、C、D中央液化坏死明显，只有周边脂肪组织结构完好；而E组坏死较少，且新生血管丰富，有些血管呈垂直状向移植物延伸移植物。移植后26、60天E组包裹纤维被膜厚，而间隔较薄，体积保持明显好于其他4组，细胞分化成熟。

2.4平均微血管密度记数：免疫组化染色后血管呈棕黄色，切片背景清晰，微血管形态不规则，管腔由染成棕黄色的内皮细胞围成（如图4）。腔内可见红细胞，部分血管无明显管腔呈条索状，有的只见到单个或成团的内皮细胞， Ad-HGF转染MSC组7天新生血管达到高峰，14天后趋于稳定。与其他4组相比较，在第3天无差异，但在术后5、7、14、28、60天时均有差异（P<0.05），如图5。

3 讨论

随着目前分子生物学、基因转染等技术的发展，为加速颗粒脂肪移植后血管的重建提供了新的思路。

HGF是一种特异的促内皮细胞生长因子，具有很强促血管内皮细胞有丝分裂、增生，抑制凋亡作用。在兔与小鼠缺血模型中，HGF 能刺激新生血管生成，且不论在体内还是体外试验HGF 的血管生成活性比血管内皮生长因子（VEGF）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）更为强大[4]。但是，HGF半衰期短，费用高，局部给药困难等缺点而难以推广应用。而我们在HGF基因加速创面血管新生方面已取得了一定的进展[5]。

本实验以腺病毒为介导，将HGF基因导入体外培养的MSCs中，和大鼠自体颗粒脂肪混合移植到其背部，发挥HGF强大的血管作用和MSC多项分化作用，共同协同促进颗粒脂肪移植体的新生血管。实验结果显示，Ad- HGF转染MSC组新生血管生成7天达高峰，提前于其他四组和文献报道[6]的14天，且无论在早期还是长期移植体血管的数量明显多于其他4组（P<0.05），从这种差异也说明了HGF起到促血管生成作用。HGF促血管生成的分子学机制可能是通过ets途径[7]。ets 家族转录因子有DNA 连接区，能连接到DNA 序列GGA 的核心上，对多种发生和促有丝分裂信号反应的基因表达起了非常重要的作用。原癌基因c-met，无论在正常还是病理条件下，在新生血管的内皮细胞上均有表达。因此，ets 家族可能激活了基因编码的胶原酶l和尿激酶纤溶酶原激活剂等的活性。ets 家族可能通过控制这些基因的转录而参与了血管生成的调节。外源HGF通过诱导ets活性可以刺激内源性HGF表达；内源性HGF系统通过自动传导功能，促进小血管生成[8]。

MSCs不仅免疫毒性很低，易于外源基因转染和表达等优点，而且移植后可促进新生血管的生成，其途径：①MSC产生VEGF、bFGF、PDGF血管生成素；②能分化成血管内皮细胞和平滑肌细胞[9]。实验结果也显示MSC组的新生血管平均数量多余空白对照组。至于MSC是否像文献报道那样能分化成血管内皮细胞和平滑肌细胞，有待进一证明。

本实验选用腺病毒为载体，该病毒有以下优点：安全、无致畸，致病及致癌性；对分裂细胞及癌细胞株的转染效率达到90%～100%；腺病毒感染细胞时DNA不整合到宿主细胞染色体中；腺病毒容易制备、纯化和浓缩，可达到较高滴度；腺病毒载体插入外原基因的容量较大。实验结果显示通过腺病毒介导，GFP基因/HGF基因成功导入MSCs，并高效表达。

综上所述，骨髓间充质干细胞经转染肝细胞生长因子基因后能持续的表达HGF，从而有效的促进自体颗粒脂肪移植后新生血管的生成，有望提高脂肪移植的远期效果。但是要将基因治疗与干细胞移植真正应用于临床，必须进一步研究这种促血管生物工程模式的安全性、稳定性和可控性。

[参考文献]

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[收稿日期]2014-06-10 [修回日期]2014-07-15

编辑/何志斌