黄芪多糖提取及对小叶杨幼苗叶绿素含量的影响

邱本军 董婉莹 薛羿 葛康康 崔荣 张玉洲 马玲

（东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040）お

摘要

［目的］研究黄芪多糖最佳提取工艺，及其对小叶杨幼苗叶绿素含量的影响。［方法］运用水煎法提取黄芪多糖，采用固液比、提取溶剂、提取温度和提取时间4个试验条件，进行单因素试验，并利用正交试验设计对提取工艺进行优化，所得黄芪多糖处理小叶杨幼苗，探究黄芪多糖对其叶绿素含量的影响。［结果］单因素试验最终获得最佳提取工艺为以5%醇碱为提取溶剂，固液比为1∶15，提取温度为60 ℃，提取1.5 h。正交试验得出优化提取工艺为以5% 醇碱为提取溶剂，固液比为1∶10，提取温度为60 ℃，提取1.0 h。10 ﹎g/ml的黄芪多糖能够显著提高小叶杨叶绿素a和总叶绿素的含量，而0.1 mg/ml黄芪多糖能够显著提高小叶杨叶绿素b的含量。

［结论］黄芪多糖能够提高植物叶绿素含量，进而促进植物的生长发育。

关键词 黄芪多糖；正交试验；小叶杨；叶绿素含量

中图分类号 SB567文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）19-06281-04

Extraction of Astragalus polysaccharide and Its Impact on The Chlorophyll Content of 玃opulus simonii

QIU Ben瞛un， MA Ling et al

（School of Forestry, Northeast Forestry University,Harbin,Heilongjiang 150040)

Abstract［Objective］ The best extraction process of Astragalus polysaccharide and its impact on chlorophyll content of popalus simonii seedlings were studied. ［Method］ Using boiling method to extract Astragalus polysaccharide by single factor experiments under solid瞝iquid ratio, solvent extraction, extraction temperature and extraction time in four experimental conditions single factor experiments. By orthogonal experimental design to optimize the extraction process.

Astragalus polysaccharide processing 玃opulus simonii 玸aplings, which investigate the effects of astragalus polysaccharides on chlorophyll content of 玃opulus simonii.

［Result］ Ultimately get the best extraction process as follows: 5% alcohol solution of an alkali as extraction solvent, solid-liquid ratio of 1∶15, extraction temperature is 60℃, extraction 1.5 h.To optimize the extraction process was obtained with 5% alcohol solution of an alkali as extraction solvent, solid-liquid ratio of 1∶10, extraction temperature is 60℃, extraction 1 h.The results show that APS 10 mg/ml can significantly increase the content of chlorophyll a and total chlorophyll, and 0.1 mg/ml Astragalus polysaccharides can significantly improve simonies chlorophyll b content.［Conclusion］ Astragalus polysaccharides can improve plant chlorophyll content, thus contributing to the growth and development of plants.

Key wordsAstragalus polysaccharide; Orthogonal experiments; 玃opulus simonii; Chlorophyll content

基金项目 大学生创新训练项目（201310225088）；黑龙江省科技攻关项目（GA09B2031）。

作者简介

邱本军（1989-），男，山东临沂人，硕士研究生，研究方向：林药学。*通讯作者,教授，博士生导师，从事植物源农药方面的研究。

收稿日期 20140604

黄芪（玆adix astragalus）是豆科植物，分为蒙古黄芪和荚膜黄芪。黄芪自古为常用的益气中药，其具有益气补虚、利水消肿、祛疮生肌等功效。黄芪多糖（Astragalus polysaccharides,APS）为黄芪中最主要的有效成分，包括葡聚糖和杂多糖［1］。自1981年黄芪多糖被分离提取出来后，其研究和作用范围不断扩大。为了进一步开发利用该有效成分，许多研究者对黄芪多糖的提取分离、纯化及多糖含量测定做了大量研究，期望找到一种经济、简便、高效的提取技术。药理研究表明：黄芪多糖具有增强人体免疫，促进抗体和免疫细胞生成，抗菌、抗病毒和抗肿瘤，抗衰老以及防辐射，双向调节血糖等作用［2-5］。但是黄芪多糖对植物的生长调节作用尚未报道。笔者运用水煎法提取黄芪多糖。用所得黄芪多糖处理小叶杨幼苗，探究其对叶绿素含量的影响。

1 材料与方法

1.1 供试材料

东北黄芪根，小叶杨幼苗（试验室种子繁殖）。

1．2研究方法

1.2.1

黄芪多糖最佳提取工艺的研究。

1.2.1.1

单因素试验设计。根据传统的水煎法［6］，设置固液比、提取溶剂、温度和提取时间4个试验条件进行单因素试验设计，并确定最佳提取工艺。其中，固液比为

1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25；提取液为水，碳酸钠，氧化钙，5%醇碱；水浴温度为60、70、80、90、100 ℃；水浴时间为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。

1.2.1.2

正交试验设计。利用正交试验研究提取黄芪多糖的最佳工艺，设置3个因素，即提取温度、提取时间、固液比,每个因素3个水平（表1），按照正交表L9（33）进行试验（表2）。

表1影响黄芪多糖提取率的因素及水平

水平 A：温度∥℃ B：提取时间∥h C：固液比

1 60 1.0 1∶2 70 1.5 1∶103 80 2.0 1∶15

1.2.1.3

多糖含量测定(硫酸-苯酚法)。①标准曲线的制作。精密称取10 mg葡萄糖，加蒸馏水定容到100 ml，配成0.1 mg/ml的标准葡萄糖溶液备用。准确量取标准葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml分别加入至10 ml带塞试管中，各试管中补加蒸馏水至2 ml，以蒸馏水作空白对照，各试管分别加入5%苯酚水溶液1 ml，混合均匀后迅速加入5 ml浓硫酸，摇匀，室温静置30 min，测定490 nm下各溶液吸光值。以吸光值獳为纵坐标，葡萄糖浓度C为横坐标绘制标准曲线［7］。②黄芪多糖含量的测定。将提取液稀释到一定倍数，取2 ml待测液加入10 ml试管中，以下按标准曲线制作方法操作。

1.2.1.4

黄芪多糖提取率。黄芪多糖提取率=［(獵×n×V)/(m×106)］×100%。其中：獵为待测液浓度（μg/ml）；玭为稀释倍数；玍为提取液总体积（ml）；玬为黄芪根粉质量（g）。

1.2.2

黄芪多糖对小叶杨幼苗叶绿素含量影响的研究。

选取生长状况良好且一致的盆栽小叶杨幼苗，分别喷洒0.01、0.1、1、10 mg/ml的黄芪多糖溶液，以清水为对照，喷洒均匀，至叶面水滴不下流为止，同时注意遮盖土壤，以免黄芪多糖喷洒到土壤中对试验结果造成影响。连续喷洒3 d。将幼苗置于10 ℃条件下培养，分别在喷洒后24、36、48 h测定其叶绿素含量［8］。

2结果与分析

2.1黄芪多糖最佳提取工艺的确定

2.1.1

标准曲线的绘制。以葡萄糖为标准物配制的葡糖糖标准溶液，采用苯酚-硫酸法在490 nm测定其吸光值。对测得数据采用回归分析法计算葡糖糖标准曲线回归方程为珁=0.013 9x-0.0901(R2=0.999 7)。由图1可以看出，在葡萄糖浓度为10～60 μg/ml范围内，浓度与吸光值呈线性┕叵怠＊

图1 葡萄糖标准曲线

2.1.2

单因素试验设计结果。

2.1.2.1

固液比。由图2可知，在固液比1∶5到1∶10范围内，多糖的提取率随固液比的增加而升高，超过1∶10后，提取率无明显提高。当固液比达到1∶15时，提取率基本不变，因此，料液比为1∶10时，多糖提取率为最佳。

图2 固液比对黄芪多糖提取率的影响

2.1.2.2

溶剂。比较不同溶剂条件下的提取率，发现以5%醇碱为溶剂的提取率最高，是水提取率的1.14倍；其次是氧化钙，是水提取率的1.13倍；碳酸钠提取率是水提取率的1.09倍（图3）。试验结果表明：在5%醇碱为溶剂的条件下，黄芪多糖的提取效果最好。

图3 提取溶剂对黄芪多糖提取率的影响

2.1.2.3

提取温度。通过比较各个温度下黄芪多糖提取率，发现多糖提取率在60 ℃时出现峰值，70~100 ℃提取率不断升高，100 ℃达到最大值，与60 ℃提取率基本一致（图4）。试验结果说明黄芪多糖在60 ℃和100 ℃条件下提取效果最好，但是100 ℃条件下有多种物质被同时提取出来，多糖结构有所变化，而且条件较60 ℃更为苛刻，不易操作，所以在60 ℃条件下提取黄芪多糖最佳。

图4 提取温度对黄芪多糖提取率的影响

2.1.2.4

提取时间。通过比较不同提取时间多糖提取率的变化，可以发现提取时间在0.5~1.5 h内，多糖提取率随时间的增加而升高，超过1.5 h，随提取时间的延长，多糖提取率基本不变，因此，提取时间为1.5 h为最佳。

通过以上单因素试验结果，可以得出最佳提取工艺为：以5%醇碱为提取溶剂，固液比为1∶15，提取温度为60 ℃，提取1.5 h，多糖提取率为19.38%。

图5 提取时间对黄芪多糖提取率的影响

2.1.3

正交试验设计结果与分析。通过正交试验结果分析得出，提取浓度、提取时间、固液比3个因子对多糖提取率的影响大小顺序为：固液比（C）、提取温度（A）、提取时间（B）（表2）。3个因素最优水平为A1B1C2，即提取温度为60 ℃，提取时间为1.0 h，固液比为1∶10，最终多糖提取率为21.42%。

表2提取黄芪多糖正交试验L9（33）结果

设计序号 A B C 多糖质量∥g 提取率∥%

1 1 1 1 0.839 5 16.674 4

2 1 2 3 0.578 6 11.479 6

3 1 3 2 1.084 1 21.424 0

4 2 1 2 0.703 7 13.870 1

5 2 2 1 0.579 5 11.439 7

6 2 3 3 0.487 9 9.723 7

7 3 1 3 0.836 1 16.652 0

8 3 2 2 0.920 0 18.158 7

9 3 3 1 0.720 0 14.205 5

K1 16.526 15.732 14.106

K2 11.678 13.693 17.818

K3 16.339 15.118 12.618

R 4.848 2.039 5.200

最优水平 1 1 2

2.2 黄芪多糖对小叶杨叶绿素含量影响的研究

黄芪多糖对小叶杨叶绿素a的影响呈波动性变化，并具有最佳浓度。在24 h时，低浓度黄芪多糖对小叶杨叶绿素a含量无明显影响，但高浓度（10 mg/ml）对其叶绿素a含量有显著的提高作用（表3）。36 h时，低浓度（0.01 mg/ml）黄芪多糖对小叶杨叶绿素a含量有显著提高作用，高浓度对叶绿素a的提高无明显作用。48 h时，除1 mg/ml浓度以外，其他各处理组均对小叶杨叶绿素a含量有显著的提高作用。因此，黄芪多糖10 mg/ml是增加小叶杨叶绿素a含量的最佳浓度。

黄芪多糖对小叶杨叶绿素b的影响呈波动性变化，并具有最佳浓度。在24 h时，高浓度（10 mg/ml）处理小叶杨时，叶绿素b含量显著提高。36 h时，除1 mg/ml处理组以外，其他各处理组均对小叶杨叶绿素b含量有显著的提高作用。48 h时，当黄芪多糖浓度为0.1 mg/ml时，小叶杨叶绿素b含量有显著提高（表4）。因此，黄芪多糖浓度为0.1 mg/ml时，是增加小叶杨叶绿素b含量的最佳浓度。

表3 叶绿素a含量的变化

mg/g

测定时间∥h处理浓度∥mg/ml

CK 0.01 0.1 1 10

24 2.245±0.024 c 1.688±0.014 b 1.348±0.022 a 2.300±0.015 c 2.507±0.057 d

36 1.705±0.111 b 2.030±0.008 c 1.784±0.014 b 1.436±0.005 a 1.708±0.008 b

48 1.587±0.005 a 1.651±0.024 b 1.717±0.003 c 1.614±0.010 a 1.825±0.022 d

表4叶绿素b含量的变化

〗mg/g

测定时间∥h 处理浓度∥mg/ml

CK 0.01 0.1 1 10

24 0.853±0.027 c 0.663±0.012 b 0.510±0.037 a 0.812±0.018 c 0.968±0.019 d

36 0.577±0.047 a 0.792±0.013 c 0.666±0.007 b 0.568±0.010 a 0.673±0.010 b

48 0.572±0.028 a 0.622±0.025 ab 0.662±0.006 b 0.591±0.002 ab 0.635±0.073 ab

黄芪多糖对小叶杨叶绿素总量的影响呈波动性变化，并具有最佳浓度。在24 h时，使用高浓度（10 mg/ml）黄芪多糖处理小叶杨时，叶绿素总含量显著提高。36 h时，低浓度（<0.1 mg/ml）黄芪多糖对小叶杨叶绿素总含量有显著提高。48 h时，除黄芪多糖浓度为1 mg/ml外，各处理组均对小叶杨叶绿素总含量有显著提高作用，且当黄芪多糖浓度为10 ﹎g/ml时，叶绿素含量提高效果极为显著（表5）。因此，10 ﹎g/ml的黄芪多糖对小叶杨叶绿素含量的提高作用最好。

表5叶绿素总含量的变化

mg/g

测定时间∥h 处理浓度∥mg/ml

24 3.097±0.046 c 2.351±0.025 b 1.858±0.060 a 3.112±0.033 c 3.475±0.076 d

36 2.281±0.157 b 2.823±0.019 d 2.450±0.021c 2.004±0.014 a 2.381±0.018 bc

48 2.158±0.032 a 2.273±0.047 b 2.379±0.008 c 2.205±0.012 ab 2.460±0.060 d

3 结论与讨论

（1）由于黄芪的种类和产地不同，所以同一种方法提取黄芪多糖也可能有不同的提取率。李红民等［9］用CaO水溶液提取黄芪多糖的粗提物，结果CaO水溶液多糖提取率最高达11.7%，是水提取率（3.6%）的3.25倍。闫巧娟等［10］采用纤维素酶处理，与对照组相比，提取率由24.4%提高至30.3%。田洛等［11］第1次采用醇碱法提取黄芪多糖，最终提取率达到19.15%。金汝城等［12］采用超声波法对提取条件进行优化，最终多糖平均含量为8.38%。该研究通过对固液比、提取溶剂、提取温度和提取时间4个试验条件进行单因素试验，最终获得最佳提取工艺为以5%醇碱为提取溶剂，固液比为1∶15，提取温度为60 ℃，提取1.5 h。利用正交试验设计对提取工艺进行优化，得出优化提取工艺为以5%醇碱为提取溶剂，固液比为1∶10，提取温度为60 ℃，提取1.0 h。经单因素试验得出的最佳提取工艺的多糖提取率为19.38%，而优化提取工艺的提取率为21.42%。

（2）叶绿素是植物光合作用的重要物质，其含量直接影响植物光合作用的能力，进而影响林木的生长和发育。研究表明，多糖类物质能够提高叶绿素含量，促进植物的生长。师素云等［13］研究发现一定浓度羧甲基壳聚糖能够提高玉米幼苗体内叶绿素的含量，调节玉米幼苗的生长。张俊风等［14］发现不同浓度的寡聚糖处理柠条种子，均能提高柠条幼苗的叶绿素含量，且存在最佳浓度。袁建平等［15-16］研究发现一定浓度寡聚糖能够提高玉米和小麦幼苗体内叶绿素含量，促进幼苗的生长。该研究表明，

在短时间内，高浓度黄芪多糖对小叶杨叶绿素a、叶绿素b及叶绿素总含量均有显著提高作用。低浓度黄芪多糖对小叶杨叶绿素含量无明显影响。但随着时间的延长，除了黄芪多糖浓度为1 mg/ml时，其他处理浓度均对小叶杨叶绿素a和叶绿素总含量有显著提高作用，且对叶绿素含量的提高作用随黄芪多糖浓度的增加而增大；仅当黄芪多糖浓度为0.1 mg/ml时，小叶杨叶绿素b含量有显著增加。由此得出，高浓度黄芪多糖能提高小叶杨体内叶绿素的含量。

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