香蕉假茎外植体愈伤组织诱导的初步研究

欧克纬 禤维言 王兴伟 冯斗

（广西大学农学院，广西南宁530004）お

摘要 ［目的］研究香蕉假茎外植体愈伤组织的最佳培养基。［方法］以香蕉组培无菌苗假茎为外植体，接种在含不同浓度配比激素的固体培养基中进行诱导培养，再将培养获得的胚性愈伤组织接种到液体培养基中进行悬浮培养。［结果］使用低浓度噻苯隆（TDZ）诱导出胚性愈伤组织的效果最好，最佳培养基为T2：MS+0.02 mg/L TDZ +7 mg/L 2，4睤。［结论］悬浮培养使用ZT2能较早建立ECS，且继代效果较好。

关键词 香蕉（玀usa nana Lour）；胚性愈伤组织；悬浮培养

中图分类号 SB188文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）19-06167-03

お

Study of Banana Cauloid Explant Callus Induction

OU Ke瞱ei et al

(Agriculture School of Guangxi University, Nanning, Guangxi 530004)

Abstract ［Objective］ To study the optimum culture medium for banana cauloid explant callus induction. ［Method］ Using the banana cauloid which are germfree as the explants, inoculate them into the soil medium containing different kinds of the hormone. When we get the embryogenic callus, inoculate them into the liquid nutrient medium and conduct suspension culture. ［Result］ The test results showed that, when we use the TDZ with low concentration, the induction effects is the best. The best medium is T2: MS+ 0.02 mg/L TDZ +2,4睤 7 mg/L. ［Conclusion］ The best liquid nutrient medium is ZT2, as ZT2 could establish the ECS as soon as possible, and could get the best result.

Key words Banana; Embryogenic callus; Suspension culture

お

作者简介 欧克纬（1986- ），女，广西桂林人，硕士研究生，研究方向：生物技术育种。

收稿日期 20140529

香蕉（玀usa nana Lour）属芭蕉科（Musaceae）芭蕉属（玀usa）单子叶植物。食用蕉多为三倍体（包括AAA、ABB、ABB等基因型），具有高度的不育性。传统的香蕉育种方法多为引种［1］，但长久种植后香蕉品种会退化或者出现抗性衰弱等现象，很容易受到病害、虫害以及寒害的威胁。如黑斑病、香蕉枯萎病、线虫病和病毒病等［2］。所以，栽培和选育抗性强、具有优良性状的香蕉新品种就显得尤为重要。香蕉体细胞胚的研究起步较晚，对此方面的研究报告也较少，研究进展较为缓慢。虽然已建立了少数几个品种的ECS［3-6］，但香蕉胚性愈伤组织的诱导难度大、建立ECS的耗时长［8］，且不同香蕉品种间差异显著［4-6，8］。

试验针对矮蕉组培苗进行切片并诱导，观察不同激素配比（使用单一细胞分裂素或使用2种细胞分裂素）的培养基对香蕉假茎切片外植体的诱导培养的效果差异，筛选能诱导矮蕉产生胚性愈伤组织的最适合培养基以及进行愈伤组织扩繁的最适液体培养体系，以期为进一步通过转基因创造具有优良性状的香蕉品种做准备。

1 材料与方法

1.1 材料 试验所用香蕉无菌苗来自广西大学农学院，品种为矮蕉；以无菌苗假茎的茎段为外植体。

1.2 方法

1.2.1 愈伤组织的诱导。选取长势良好的无菌苗，去除根部及叶片等后，将无菌苗假茎切块，长度为0.6 cm。分别接种于MS附加激素TDZ、6BA、ZT的培养基中（配方见表1）。每隔10 d观察1次，培养50 d后统计各个培养基中外植体褐化块数、愈伤组织块数以及胚性愈伤组织块数。计算愈伤组织诱导率、胚性愈伤组织诱导率以及褐化率：愈伤组织诱导率=愈伤组织块数/接种总块数；胚性愈伤组织诱导率=胚性愈伤组织块数/接种总块数；褐化率=褐化块数/接种总块数。

1.2.2 培养条件。培养基中琼脂含量为7 g/L，蔗糖30 ゞ/L，pH为5.8，接种矮蕉每个配方10瓶，每瓶8块外植体。接种后的外植体先暗培养3 d，再进行光照培养，16 h/d，光照强度1 500~2 000 lx，培养温度为（25±2）℃。

表1 不同植物生长调节剂组合的培养基

培养基编号 TDZ∥mg/L 6睟A∥mg/L ZT∥mg/L 2，4睤∥mg/L

T2 0.02 0 0 7.0

T3 0.50 0 0 7.0

T4 1.00 0 0 7.0

TB1 0.02 1.0 0 7.0

TB2 0.50 0.7 0 7.0

TB3 1.00 0.5 0 7.0

BZ1 0 1.0 1.0 7.0

BZ2 0 0.7 2.0 7.0

BZ3 0 0.5 4.0 7.0

XB3 0 1.0 0 5.0

XB4 0 1.0 0 7.0

1.2.3 胚性细胞悬浮系（ECS）的建立。60 d后挑取通过诱导产生的长势良好的胚性愈伤组织颗粒，分别放入50 ml的三角瓶中，加入不同浓度玉米素（ZT）的液体培养基10 ml，放入摇床中进行悬浮培养。液体培养的基础培养基为1/2MS培养基（不含铁盐和肌醇）；摇床转速为100 r/min，光照16 h/d，光照强度为2 000 lx，培养温度为（27±2）℃。不同ZT浓度液体培养基配制见表2。

お

表2 不同ZT浓度的液体培养基

养基编号 Vitamin C∥mg/L 2，4睤∥mg/L ZT∥mg/L

ZT1 10.0 1.0 12.5

ZT2 10.0 1.0 25.0

ZT3 10.0 1.0 50.0

10 d后分别往各个培养基中加入10 ml对应的液体培养基。20 d后吸取悬浮培养系的上清液，再加入对应的新鲜培养基进行继代培养。每隔10 d进行1次继代培养，60 d后肉眼观察细胞长势。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织的诱导 接种到各个不同培养基中的香蕉无菌苗假茎，20 d后外植体即出现较为明显的膨大，30 d后部分外植体出现褐化，40 d后出现白色蓬松状愈伤组织，40~50 d出现淡黄色或黄色的胚性愈伤组织（图1）。培养50 d后统计各个培养基中外植体的褐化数、愈伤组织数以及胚性愈伤组织数，并计算胚性愈伤组织诱导率。

由表3可知，只使用TDZ的T2、T3和T4培养基愈伤组织诱导率最高，混合使用2种细胞分裂素的TB系列和以及单独使用6睟A的XB系列培养基的愈伤组织诱导率较低，

BZ系列的愈伤组织诱导率最低。使用低浓度TDZ的T2、T3

培养基及BZ2的培养基胚性愈伤组织诱导率最高，均为

11.25%，只单独添加6睟A的XB系列培养基及混合使用2种细胞分裂素的TB系列培养基胚性愈伤组织诱导率均较低，而BZ3的胚性愈伤组织诱导率最低，为0。褐化率最低的培养基则为T2。T3和BZ2培养基的褐化率均高于T2培┭基。

图1 香蕉假茎诱导的愈伤组织

表3 不同植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响

培养基编号 接种外植体ぷ苁∥块 愈伤组织た 愈伤组织诱さ悸省% 胚性愈伤组ぶ∥块 胚性愈伤组织び盏悸省% 褐化数た 褐化率%

T2 80 47 58.75 9 11.25 9 11.25

T3 80 54 67.50 9 11.25 26 32.50

T4 80 65 81.25 4 5.00 13 16.25

TB1 80 12 15.00 6 7.50 47 58.75

TB2 80 11 13.75 1 1.25 28 35.00

TB3 80 10 12.50 3 3.75 61 76.25

XB3 80 12 15.00 5 6.25 52 65.00

XB4 80 13 16.25 5 6.25 62 77.50

BZ1 80 5 6.25 1 1.25 37 46.25

BZ2 80 13 16.25 9 11.25 41 51.25

BZ3 80 1 1.25 0 0 40 50.00

2.2 胚性细胞悬浮系（ECS）的培养 胚性愈伤组织接种至不同浓度ZT的液体培养基中进行悬浮培养，12 d后接种的胚性愈伤组织颗粒出现褐化，约30 d后悬浮系逐渐形成，60 d后悬浮细胞浓度较稳定。

由表4可知，使用ZT2培养基（含25 mg/L ZT）悬浮培养的效果最好，也最早出现胚性细胞悬浮系（约为30 d），胚性细胞悬浮系的浓度较高，长势良好；ZT3培养基玉米素浓度最高，接种的胚性愈伤组织颗粒出现褐化的时间也最早（约为10 d），形成细胞悬浮系用时最长（约为50 d），胚性细胞悬浮系浓度较低，长势一般；ZT1玉米素使用浓度最低，开始出现褐化的时间最长（为14 d），开始出现胚性细胞悬浮系的时间也较晚（约为40 d），形成的胚性细胞悬浮系浓度不高，长势较好（图2）。

お

表4 不同浓度ZT对悬浮培养的影响

培养基编号 开始出现褐化さ氖奔洹蝑 开始出现悬浮さ氖奔洹蝑 悬浮细胞长势

ZT1 14 40 ++

ZT2 12 30 +++

ZT3 10 50 +

注：“+”表示生长情况一般，“++”表示生长情况较好，“+++”表示生长情况良好。お

图2 香蕉胚性细胞悬浮系生长情况

3 结论与讨论

使用矮蕉无菌苗假茎为外植体诱导产生胚性愈伤组织以及建立ECS的时间均较长，难度均较大，此领域的相关研究报告也较少。TDZ作为具有高活性的细胞分裂素可用于诱导香蕉等难以培养的植物。使用低浓度单一细胞分裂素TDZ时，矮蕉的假茎切片胚性愈伤组织诱导率最高。可能是由于TDZ具有强细胞分裂素活性，较高浓度抑制胚性细胞的诱导，这与刘晓光等［9］的观点一致，他对枣叶愈伤组织的诱导进行了研究，结果显示TDZ浓度过高时诱导形成的愈伤组织质硬且量少，出愈率低。配合使用其他细胞分裂素（6睟A，ZT）时也不利于矮蕉假茎愈伤组织的诱导，这可能与植物激素的种类、浓度以及它们之间的组合使用情况有关［10］。使用25 mg/L细胞分裂素ZT，胚性细胞悬浮系建立起来的时间最短，悬浮细胞的长势也较好。低浓度ZT继代的效果较差，而高浓度ZT有可能抑制胚性细胞悬浮系的生长。故设定的培养基中，诱导矮蕉假茎切片胚性愈伤组织的最适宜培养基为T2培养基（MS+0.02 mg/L TDZ+ 7 mg/L 2，4睤），最适宜液体培养基为ZT2培养基（1/2MS大量元素+MS微量元素+ 10 mg/L V瑿+ 1.0 mg/L 24，D+25 mg/L ZT ）。

胚性愈伤组织既是诱导体胚再生植株的重要材料，又是原生质体培养、细胞融合及外源基因转化的理想材料［11］。总体来说，香蕉胚性愈伤组织诱导率较低（通常小于1%），且品种间差异大，只能从约1/5~1/2质量好的胚性愈伤组织中获得ESC［8］。试验只是针对矮蕉进行了初步的研究，而如何筛选出适用于不同香蕉品种的诱导培养体系仍需广大科研工作者的不屑努力。

参考文献

［1］ 李宝荣，张向平.目前国内主栽香蕉品种的引种过程及存在的问题［J］.中国南方果树，2002，31（4）：30-31.

［2］ 刘进平，莫饶.热带植物组织栽培［M］.北京：科学出版社，2006：68.

［3］ DHEDA D，DUMORTIER F，PANIS B，et al.Plant regeneration in cell suspension cultures of the cooking banana cv.“Bluggoe”（Musaspp.ABB group）［J］.Fruits，1991，46（2）：125-135.

［4］ ESCALANTJ V，TEISSONC，COTE F X.Amplified somatic embryogenesis from male flowers of triploid banana and plantain cultivars（Musasp.）［J］.In Vitro Cell Dev Biol Plant，1994，30：181-186.

［5］ COTE F X，DOMERGUE R，MONMARSON S，et al.Embryogenic cell suspensions from the male flower of MusaAAA cv.Grand Nain［J］.Physiol Plant，1996，97：285-290.

［6］ GRAPINA，ORTIZ J L，LESCOTT，et al.Recovery and regeneration of embryogenic culture from female flower of False Horn plantain（MusaAAB）［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2000，61：237-244.

［7］ 徐春香，PANIS B，STROSSE H，等.香蕉胚性愈伤组织的诱导及胚性细胞悬浮系的建立［J］.华南农业大学学报，2004，25（1）：70-73.

［8］ SCHOOFS H，PANIS B，STROSSE H，et al.Bottlenecks in the generation and maintenance of morphogenic banana cell suspensions and plant regenerationviasomatic embryogenesis therefrom［J］.Info Musa，1999，8（2）：3-7.

［9］ 刘晓光.枣愈伤组织诱导和原生质体分离研究［D］.保定：河北农业大学，2006.

［10］ 冯大领，孟祥书，王艳辉，等.植物生长调节剂在植物体细胞胚发生中的应用［J］.核农学报，2007，21（3）：256-260.

［11］ 鲁旭东，萧浪涛，刘素纯，等，2，4睤对石刁柏愈伤组织诱导的影响［J］.安徽农业科学，2006，34（21）：5546-5548.