萝卜清除DPPH自由基活性研究

段艳波 蒋福宇 高品一 刘学贵

(沈阳化工大学制药与生物工程学院，辽宁沈阳 110142)お

摘要

［目的］研究萝卜清除DPPH自由基的活性。［方法］通过对萝卜叶水提物、水提物不同极性部位萃取物、萝卜中脂肪油类有效成分β补如薮冀行清除DPPH（1,1捕苯基2踩硝基苯肼）自由基活性测试，对萝卜的抗氧化能力进行评价。［结果］以柠檬酸为对照其清除能力大小顺序为：乙酸乙酯层 >二氯甲烷层>萝卜叶水提物>β补如薮>石油醚层>柠檬酸。［结论］萝卜具有较好的抗氧化能力。

关键词 萝卜叶水提取物；不同极性部位萃取物；β补如薮迹籇PPH自由基

中图分类号 SB188文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）19-06155-02

お

Research on DPPH Free Radical Scavenging Activity of Radish

DUAN Yan瞓o, LIU Xue瞘ui et al

(College of Pharmaceutical and Biological Engineering, Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang, Liaoning 110142)

Abstract ［Objective］ To study DPPH free radical scavenging activity of radish. ［Method］ This paper clears testing DPPH (1,1瞕iphenyl3瞡itrophenylhydrazine) free radical scavenging activity of the different polarities of water extracts from Radish leaves and the compound of β瞫itostero by isolating from radish. ［Result］ Using citric acid as standard, the order of the scavenging ability is ethyl acetate layer > dichloromethane layer >radish leaf extract > sitosterol > petroleum ether layer> citric acid. ［Conclusion］ Radish has a good antioxidant capacity.

Key words Radish leaf extract; Different polar parts; β瞫itostero; DPPH free radical scavenging

お

作者简介

段艳波(1991-)，男，内蒙古赤峰人，本科，专业：天然药物化学。*通讯作者，副教授，博士，从事天然产物及其衍生物的活性和制备工艺研究。

收稿日期 20140606

萝卜（玆aphanus sativus 獿.）又名菜菔、芦菔、菜头、雹突等，为十字花科萝卜属（玆aphanus）1年或2年生的草本植物，在我国具有悠久的食品和药品的使用历史［1］。据国内外文献报道，萝卜中的化学成分主要有生物碱、黄酮、三萜皂苷、脂肪油、挥发油、硫代葡萄糖苷酯、有机酸和多糖等［2-3］。萝卜成熟的种子、根、叶中的有效成分均有很好的药用价值。研究显示，萝卜具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌、降压、止咳化痰、止血、利尿和增加小肠的蠕动等药理作用［4-12］。萝卜的产量大、种植栽培技术成熟，且容易贮存，是具有广泛应用价值的药食两用植物。

DPPH（1,1捕苯基2踩硝基苯肼）自由基是合成的一种稳定的氮中心的自由基，主要由于其3个苯环的共轭稳定作用及空间障碍，导致氮原子电子不能与电子成对。清除DPPH自由基试验的原理为清除剂和DPPH自由基孤对电子配对，使紫色消失变为黄色，在紫外517 nm波长处测得的吸光度变小，清除剂的清除能力越强吸光度越小（图1）。因为其结构简单并且容易控制反应，所以清除DPPH自由基是现今抗氧化活性评价和筛选应用最广泛的方法之一［13-15］。笔者以柠檬酸为对照品，对萝卜叶水提物、水提物不同极性部位萃取物、萝卜中脂肪油类的有效成分β补如薮冀行清除DPPH自由基活性研究，对萝卜的抗氧化能力进行评价，以期为萝卜抗氧化活性成分的跟踪分离研究提供试验依据。

图1DPPH自由基结构及作用原理

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1

研究对象。白萝卜叶，产地辽宁省沈阳市，经鉴定为萝卜（玆aphanus sativus 獿.）的新鲜叶。

1.1.2

主要仪器。RE5205旋转蒸发器，购自上海亚荣有限公司；TD5102电子天平，购自余姚市金诺天平仪器有限公司；GZX睤(Ⅲ)循环式真空水泵，购自巩义市予华仪器有限责任公司；UV3系列紫外可见分光光度计，购自上海光谱达仪器有限公司；HZC超声波清洗器，购自福州志科学仪器有限公司。

1.1.3

主要试剂。DPPH（1,1捕苯基2踩硝基苯肼），购自TCI公司；柠檬酸，购自天津是永大化学试剂有限公司；抗坏血酸，购自中国国药化学试剂公司；其他试剂均为分析纯，购自中国国药化学试剂公司。

1.2 方法

1.2.1

总提物及其不同极性部位萃取物的制备。将采集的萝卜叶晾干，取干燥的萝卜叶放入水浴锅中，在20 ℃条件下水浴提取18 h，提取完毕，过滤，收集滤液。取滤液500 ml，分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯1 000 ml，萃取3次，萃取完毕，旋蒸，挥干，制得,3个极性部位萃取物的浸膏，待用［16］。

1.2.2

DPPH自由基储备液的配置。准确称取DPPH粉末置于15 ml EP管中，量取10 ml无水乙醇加入EP管中配置得到2 mmol/L的DPPH储备液。取1 ml储备液加9 ml无水乙醇置于15 ml EP管得到0.2 mmol/L的DPPH待用。

1.2.3

样品储备液及其浓度梯度的配置。准确称取样品粉末（石油醚组分、二氯甲烷组分、乙酸乙酯组分、萝卜叶水提物、β补如薮肌⒛檬酸）5 mg置于15 ml EP管中，量取10 ml浓度70%无水乙醇加入EP管中，配置得到0.5 mg/ml的样品储备液；再用浓度70%无水乙醇将7种样品储备液分别稀释至质量浓度梯度为1.0、5.0、10.0、20.0、30.0和40.0 │蘥/ml，得到试验样品。

1.2.4

DPPH自由基最大波长的确定。对0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液在350~800 nm范围进行波长扫描［17-18］，考察最佳测定波长。

1.2.5

DPPH自由基稳定性试验。用0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液与0.04 mmol/L的抗坏血酸混合，在波长517 nm处监测其吸光度，每隔2 min记录1次，建立吸光度(玒)与时间(X)的关系。お

1.2.6

清除DPPH自由基试验。配置萝卜叶不同极性段样品质量浓度梯度（1.0、5.0、10.0、20.0、30.0和40.0 μg/ml）和0.2 mmol/L的DPPH。样品组：用移液枪准确移取100 μl的DPPH和100 μl不同浓度梯度的样品置于96孔板孔中，避光反应40 min，在517 nm下测其吸光度值为獳璱。样品本底组：准确移取100 μl的样品和100 μl的无水乙醇，其吸光度值为獳璲；空白对照组：准确移取100 μl的DPPH和100 μl的无水乙醇，其吸光度值獳璫。每组进行3次平行试验。DPPH自由基清除率计算公式如下：

清除率=1-獳璱-A璲 A璫×100%オ

根据不同浓度梯度的样品对DPPH自由基的清除率，绘制6种不同样品对DPPH自由基的清除率曲线，并对各曲线进行线性拟合，得到6种不同样品的獻C50值［20］。

2 结果与分析

2.1 DPPH自由基最大波长的确定

结果显示，DPPH自由基约在517 nm处有最大吸收峰。

图2 0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液全波长扫描结果

2.2 DPPH自由基稳定性试验

图3表明，0~2 min随时间变化吸光度呈线性迅速下降；2~35 min后变化很小，吸光度趋近于稳定状态，35 min后吸光度基本无变化。因此，由DPPH自由基稳定性试验可以确定，为了提高清除DPPH自由基测试精确性，在加入样品反应35~40 min后测量反应物吸光度［19］。

图3DPPH自由基稳定性试验

2.3 样品的DPPH自由基清除曲线

图4表明，各样品对DPPH的清除率接近指数关系，在样品浓度梯度较低时清除率随着浓度增加近似为线性关系，而浓度较大时清除率趋于稳定。在近似线性范围内，根据质量浓度（μg/ml）玐，清除率（%）玒的关系对各曲线进行线性拟合［21］。

图46种样品对DPPH自由基的清除曲线

2.4 样品清除DPPH自由基的能力确定

根据6种样品的清除曲线，确定各样品的獻C50值（见表1）［22］。结合图4和表1可以确定，6种样品的清除能力的大小顺序为：乙酸乙酯层>二氯甲烷层>萝卜叶水提物>β补如薮>石油醚层>柠檬酸。

表16种样品的线性方程、线性范围、玆2及IC50值

样品 样品名称 线性方程 线性范围う蘥/ml 玆2 IC50值う蘥/ml

1 石油醚组分 玒=0.506 9X+27.600 1 1~50 0.927 4 48.6

2 二氯甲烷组分 Y=0.763 3X+32.587 3 1~40 0.893 6 18.0

3 乙酸乙酯组分 Y=1.110 0X+31.233 7 1~30 0.954 6 14.6

4 萝卜叶水提物 Y=0.746 9X+26.638 8 1~40 0.946 5 28.9

5 β补如薮 Y=0.6031X+28.744 2 1~50 0.932 2 31.4

6 柠檬酸 Y=0.336 5X+20.888 5 1~40 0.996 2 -

3结论

试验以DPPH自由基最大波长的确定试验、DPPH自由

基稳定性考察为基础，对萝卜叶水提取物、水提物的不同极性部位萃取物、萝卜中的脂肪油类化合物β补如薮冀行DPPH（1,1捕苯基2踩硝基苯肼）自由基清除能力试验。结果表明，在乙醇体系、波长517 nm的条件下，测定6种样品清除DPPH自由基的獻C50值，判断其清除DPPH自由的活性大小顺序为：乙酸乙酯层 >二氯甲烷层 >萝卜叶水提物 >β补如薮>石油醚层>柠檬酸。由此得出结论，萝卜具有较好的抗氧化能力。同时，对萝卜抗氧化活性成分的跟踪分离提供试验依据。

参考文献

［1］ 汪隆植,何启伟.中国萝卜［M］.北京:科学技术文献出版社,2005:1-6.

［2］ 段礼新,蔡光明,陈芳,等.莱菔的研究进展［J］.解放军药学学报,2007,23(3):204-206.

［3］ 赵功玲,郝睿,由宏,等.八种萝卜籽油的组成与抗氧化活性［J］.中国油脂,2011,36(12):73-76.

［4］ 谭鹏,姜虹玉,吕文海.莱菔子研究概况［J］.实用中医药杂志,2005,21(4):254-257.

［5］ 陈素美,徐江雁.中药莱菔子药理及临床应用研究回顾［J］.时珍国医国药,2007,18(12):3117-3118.

［6］ 张旭,马波,杜钢军,等.白萝卜提取物对小鼠胃排空、肠推进及家兔离体回肠平滑肌的影响［J］.河南大学学报：医学版,2011,30(1):36-38.

［7］ NAKAMURA Y,NAKAMURA K,ASAI Y,et al.Comparison of the Glucosinolate睲yrosinase Systems among Daikon (Raphanus sativus,Japanese White Radish) Varieties［J］.J Agric Food Chem,2008,56(8):2702-2707.

［8］ 郑一美,周福富.莱菔叶的药效应用及有效成分的提取分离研究［J］.亚太传统医药,2008,4(11):49-50.

［9］ 李东华,叶春苗.萝卜籽中活性成分提取及抑菌效果的研究［J］.沈阳化工大学学报,2013,27(1):25-26.

［10］修丽丽,钮昆亮.十字花科植物中的硫代葡萄糖苷及其降解产物［J］.浙江科技学院学报,2004,16(3):187-188.

［11］ 赵功玲,梁新红,杨淑媛,等.萝卜籽油对大豆油和花生油的抗氧化作用［J］.中国油脂,2012,37(9):54-56.

［12］ 余跃东,郁建平.萝卜籽油成分研究［J］.食品科学,2005,26(8):331-332.

［13］ 熊双丽,卢飞,史敏娟,等.DPPH自由基清除活性评价方法在抗氧化剂筛选中的研究进展［J］.食品工业科技, 2012,33(8):380-381.

［14］ 韦龙宾,陈丛瑾,朱栗琼，等.马鞭草科一些植物鲜叶提取物清除DPPH自由基活性的研究［J］.安徽农业科学,2007,35(20):6011-6012

［15］ 谭榀新,叶涛,刘湘新,等.植物提取物抗氧化成分及机理研究进展［J］.食品科学,2010,31(15):288-289.

［16］ 郭志琴,吕海宁,陈巧莲,等.野坝子体外清除自由基活性研究［J］.中国实验方剂学杂志,2010,16(11):180-181.

［17］ 卢怡雯,李晓芬,项朋志，等.没食子酸清除DPPH自由基的紫外-可见吸收光谱研究［J］.食品工业科技,2014, 35(2)：124-125.

［18］ 陈丛瑾,黄克瀛,孙崇鲁.白英果提取物清除DPPH自由基活性研究［J］.食品研究与开发,2006,27(10):45-46.

［19］ 贺晓华,许龙,谈满良，等.不同提取方法赶黄草提取物清除DPPH自由基的作用研究［J］.时珍国医国药,2009,20(8):1924-1925.

［20］ 赵爽,严铭铭,赵大庆，等.小飞蓬总黄酮提取工艺优选及体外抗氧化活性研究［J］.中成药,2011,33(2):350.

［21］ 郑德勇,安鑫南.竹叶提取物清除DPPH自由基的测定方法［J］.福建农林大学学报：自然科学版,2005,34(1):60-62.

［22］ 皮子凤,侯广月,艾军，等.化学计量学方法研究北五味子中木脂素含量与抗氧化活性的相关性［J］.中国中药杂志,2012,7(8):1133-1135.