酶解条件对黄瓜原生质体分离效果的影响

岳备 黄玉兰 林晓婷 耿士庄 赵国峰 梁晓庆 刘延明

（黑龙江八一农垦大学生命科技学院，黑龙江大庆 163319）お

摘要

［目的］研究黄瓜原生质体分离的最佳酶解条件。［方法］以黄瓜子叶和悬浮细胞为材料，研究不同酶解条件对其原生质体的分离效果的影响。［结果］黄瓜子叶获得高质量的原生质体的最佳条件为：酶液组合2%纤维素酶+1.0%果胶酶，酶解时间8 h，酶液浓度0.7 mol/L，酶液pH 5.5。［结论］该试验研究了不同酶解条件对黄瓜原生质体的分离效果的影响，为黄瓜的进一步开发利用提供依据。

关键词黄瓜(獵ucumis sativus 獿. )；原生质体；酶解条件；离心

中图分类号 SB642.2文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）19-06145-03

お

The Effect of Decomposing Conditions on Protoplast Isolation of Cumber

YUE Bei, HUANG Yu瞝an et al

(Faculty of Biological Life, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing, Heilongjiang 163319)

Abstract ［Objective］ To study the optimal enzymolysis conditions on protoplast isolation ofcumber. ［Method］ Using cotyledons and suspension of cumber as test materials, effects of various enzymolysis conditions on protoplast isolation were studied. ［Result］ The optimum conditions for high yield of viable protoplast were as follows: enzyme combination containing 2% cellulase + 1.0% pectinase, mannitol concentration at 0.7 mol/L, enzymolysis time of 8 h and pH=5.5. ［Conclusion］ Effects of different enzymolysis conditions on protoplast isolation of cumber were studied, which will provide basis for further development and utilization.

Key words 獵ucumis sativus 獿.; Protoplast; Enzymolysis conditions; Centrifugation

お

基金项目 黑龙江省青年科学基金(QC2012C103)；校级大学生创新创业训练计划项目（2013100223003）。

作者简介

岳备(1991-)，男，河北邢台人，本科，专业：制药工程。*通讯作者，硕士，从事植物细胞工程研究。

收稿日期 20140529

黄瓜(獵ucumis sativus 獿.)是葫芦科(Cucurbitaceae)黄瓜属(獵ucumis)一年蔓生草本植物，是我国主要的蔬菜作物之一，其播种面积和总产量在我国主要蔬菜中位居前列［1］。“优质、高产、多抗、生态、高效”黄瓜新品种的选育迫在眉睫。传统的转基因抗病育种，可能会产生诸如启动子、标记基因等外来因素，带来潜在的危险性，并且远缘杂交的不亲和性阻碍了这些技术在黄瓜育种中的应用。以原生质体融合为基础的体细胞杂交技术可以克服远缘杂交的前述困难，实现不同物种部分基因组或特异染色体的转移，在转基因育种应用中还可以把外源目的基因导入原生质体，创造出新的种质┳试椽［2］。

分离高质量原生质体是进行原生质体培养和体细胞杂交的前提，黄瓜属间原生质体融合研究还很少，且没有得到再生植株［3-4］。主要是原生质体的产量和活力限制了该方法在黄瓜育种上的应用。原生质体产量和活力在很大程度上取决于材料来源、水解酶组成、酶解时间等酶解条件。目前，国内对植物黄瓜原生质体的制备、纯化及融合的研究相对较少，试验以黄瓜子叶和悬浮细胞为材料，研究不同酶液组合、酶解时间、酶液渗透压及酶液pH值等不同条件对其原生质体的分离效果，以期为制备高质量的黄瓜原生质体提供理想条件与参数，并为进一步利用植物细胞融合技术改良和生产黄瓜提供理论基础。

1材料与方法

1.1 材料

元丰园黄瓜种子；甘露醇，购自天津市福晨化学试剂厂；纤维素酶(Onozuka R-10)和果胶酶(Macerozyme R-10)，购自日本。

1.2 方法

1.2.1

无菌苗和胚性愈伤组织的制备。精选饱满的黄瓜元丰园种子，水浸种10~20 min后，用70%乙醇处理20~30 s，然后用0.1% HgCl2消毒8~10 min，再用无菌水洗涤4~5次，胚根端插入MS附加0.3%蔗糖和0.7%琼脂的固体培养基中，置于(25±2)℃，1 000 lx光照13~15 h/d下培养，制备无菌苗。

将5~7 d无菌苗子叶叶片切成0.5 cm×0.5 cm的小块，用长柄镊子将切好的外植体接种到诱导培养基中，进行愈伤组织诱导获得初代愈伤组织。初代愈伤组织在3种激素6睟A、IAA、AgNO3的调控下，继代培养成胚性愈伤组织。将胚性愈伤组织接种液体培养基中进行悬浮培养，获得黄瓜悬浮细胞。

1.2.2

黄瓜子叶和悬浮细胞的原生质体制备［5-7］。选取植株顶端未充分展开的幼嫩子叶，清水冲洗干净，75%酒精浸泡数秒，再用0.1%升汞溶液消毒7 min，然后用无菌水清洗4~5次，撕下叶片下表皮，并将去掉下表皮一面置于盛有酶液培养皿中，在黑暗条件下25 ℃恒温摇床上50 r/min振荡，以分离原生质体。

取继代5~10 d质地疏松的黄瓜悬浮细胞1~2 g，置于盛有10 ml酶液的培养皿中，盖上盖Parafilm膜封口。25 ℃、50 r/min的摇床上黑暗振荡酶解，以分离原生质体。

1.2.3

不同酶解条件对其原生质体的分离效果。①酶种类与浓度。酶液由纤维素酶和果胶酶组成以0.9 mol/L甘露醇作为渗透压调节剂。采用随机组合试验设计，其中纤维索酶浓度设3个水平：2％，1.5 ％，1.0％。果胶酶浓度设3个水平：2.0％，1.5％，1.0％。②酶解时间。酶解时间设为2、4、6、8和10 h共5个水平。③甘露醇浓度。甘露醇浓度(﹎oI/L)设5个水平0.5，0.6，0.7，0.8，0.9。④酶液pH值。酶液的pH值设5个水平：4.5，5.0，5.5，6.0，6.5。

1.2.4

黄瓜原生质体纯化与检测。酶解后，悬浮液用300目滤网过滤，600 r/min离心5 min，收集原生质体。收集到的原生质体采用界面法［8-9］进一步纯化。所有试验重复3次，取平均值。原生质体产量用血球计数板计数，以每g鲜重子叶和悬浮细胞分离得到的原生质体个数 (个/g)来表示，用0.01%酚藏红花染色测定原生质体活性，相关计算式如下：原生质体密度(个/ml)=每个小格内的原生质体平均数×400×104×稀释倍数；原生质体产量（个 /g）= 悬浮液中的原生质体数（个/ml）×总体积（ml）/ 质量（g）；原生质体的完整率(%)=完整原生质体个数(玿)/原生质体总数(X)；完整产率(个/g)=原生质体的产率(个/g)×原生质体的完整率(%)；存活率(%) = (未染色原生质体数/原生质体总数)×100%；有活力原生质体产量（个/g）=原生质体产量×存活率。

2 结果与分析

2.1 黄瓜胚性愈伤组织诱导及悬浮细胞培养

由子叶诱导的愈伤组织呈黄绿色，组织生长良好。在优化的培养基上进行黄瓜细胞的悬浮培养，悬浮细胞可不断增值，状态良好(图1)。

图1黄瓜原生质体（A:子叶；B:悬浮细胞）

2.2 酶浓度对不同材料黄瓜原生质分离的影响

将继代7 d生长活性较高的悬浮细胞和7~9 d黄瓜无菌苗子叶，分别置于表1所示2种不同组合酶液中。由表l可知，纤维素酶浓度一定时，随果胶酶浓度的增加，原生质体产量先增后减，当果胶酶浓度为1.0％时产量最高。当果胶酶浓度一定时，原生质体产量随着纤维索酶浓度先增后减。综合考虑，原生质体产率适中、原生质体活力产量较高、完整率较高的酶液组合为纤维素酶2%+果胶酶1.0%。

在原生质体密度和活力原生质体产量方面，子叶和悬浮细胞二者作为起始材料出现较大差别。在最佳酶浓度组合下，子叶和悬浮细胞活力原生质体的产率分别为7.5×106个/g和6.9×106个/g，完整率没有太大的差别。从整体上来看，子叶以其较高的活性和较高的完整率成为最佳可选┎牧稀＊

表1 酶液组成对原生质体分离的影响

酶液浓度∥%

纤维素酶果胶酶

子叶

原生质体总量106个/gFW 活力原生质体产量106个/gFW 完整率106个/gFW

悬浮细胞

原生质体总量106个/gFW 活力原生质体产量106个/gFW 完整产率106个/gFW

3 1.5 6.5±0.2 6.1±0.4 5.7±0.1 7.6±0.1 6.0±0.1 5.6±0.1

3 1.0 6.7±0.1 6.3±0.1 5.8±0.4 7.8±0.4 6.1±0.4 5.8±0.4

3 0.8 6.3±0.4 5.8±0.2 5.4±0.5 7.5±0.2 5.8±0.3 5.5±0.2

2 1.5 6.9±0.2 6.4±0.7 6.0±0.4 7.9±0.4 6.3±0.2 6.1±0.3

2 1.0 7.8±0.4 7.5±0.1 6.9±0.2 8.9±0.3 6.9±0.4 6.8±0.4

2 0.8 7.5±0.2 7.0±0.2 6.7±0.1 8.8±0.6 6.7±0. 6.8±0.2

1 1.5 6.2±0.1 5.6±0.3 5.3±0.5 6.7±0.1 5.4±0.4 5.4±0.4

1 1.0 6.5±0.4 6.0±0.5 5.3±0.8 6.9±0.3 5.9±0.2 5.5±0.5

1 0.8 5.9±0.5 6.1±0.2 5.2±0.4 6.4±0.4 5.3±0.3 5.3±0.3

2.3 酶解时间对黄瓜原生质体分离的影响

在2.0%纤维素酶+1.0%果胶酶酶液中，研究了不同的酶解时间对子叶原生质体游离产率和完整率的影响。结果（表2)表明，在酶解4 h后便有少量原生质体生成，随着时间的延长，原生质体的数量也逐渐增加；酶解8 h便产生大量原生质体，其活力和完整率为最佳，随着酶解时间的延长，会出现活力和完整率下降的趋势。

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表2 酶解时间对原生质体分离的影响

组别 酶解な奔洹蝖 原生质体总量106个/gFW 活力原生质体产量106个/gFW 完整率106个/gFW

1 2 0.6±0.2 0.3±0.1 0.1±0.1

2 4 3.1±0.3 2.5±0.2 1.8±0.2

3 6 4.8±0.4 4.1±0.2 3.1±0.2

4 8 7.1±0.2 7.0±0.4 5.9±0.5

5 10 6.9±0.2 6.7±0.3 4.6±0.3

2.4 甘露醇浓度对原生质体分离效果的影响

在2.0%纤维素酶+1.0%果胶酶酶液中添加不同浓度的甘露醇，酶解8 h，比较原生质体的分离情况，结果见表3。随着甘露醇浓度的增加，原生质体产量和有活力原生质体产量都随之增加，当浓度达0.7 mol/L时，有活力原生质体的产量最高，为7.0×106个/g，完整率为5.9×106个/g，获得的原生质体形状、大小基本一致，边缘清晰，内含物多，完整率较高。随着甘露醇浓度的升高，原生质体的产量和有活力原生质体的产量开始下降。

表3 不同甘露醇浓度对原生质体分离的影响

组别 甘露醇づǘ取蝝ol/L 原生质体总量106个/gFW 活力原生质体产量106个/gFW 完整率106个/gFW

1 0.5 5.6±0.3 5.0±0.6 4.1±0.3

2 0.6 6.4±0.2 5.9±0.5 4.7±0.2

3 0.7 7.8±0.2 7.0±0.2 5.9±0.4

4 0.8 6.9±0.5 6.7±0.3 4.6±0.2

5 0.9 6.8±0.4 5.9±0.1 4.3±0.3

2.5 酶液pH值对黄瓜原生质体分离的影响

在2.0%纤维素酶+1.0%果胶酶酶液中添加0.7 mol/L甘露醇，酶解8 h，比较原生质体在不同pH值时的分离情况，结果见表4。当pH为4.5时，有活力的原生质体产量较低，细胞完整率较低，随着pH值的逐渐升高，产量逐步增加，原生质体状态较好；当pH为5.5时，活力原生质体产量高（7.0×106个/g），有活力原生质体产率和完整率都较高；随着pH值的升高，有活力原生质体的产量开始下降，完整率降低。

表4 不同酶液pH对原生质体分离的影响

组别 pH值mol/L 原生质体总量106个/gFW 活力原生质体产量106个/gFW 完整率106个/gFW

1 4.5 3.1±0.2 2.7±0.1 2.4±0.2

2 5.0 4.5±0.3 3.9±0.3 3.2±0.3

3 5.5 7.8±0.5 7.0±0.4 6.2±0.1

4 6.0 6.9±0.4 6.1±0.5 4.7±0.4

5 6.5 5.1±0.3 4.2±0.3 3.1±0.3

3结论与讨论

起始材料是影响植物原生质体分离培养的重要因素［10-11］。试验以黄瓜无菌苗子叶和悬浮细胞为材料，对分离制备的原生质体的效果进行比较，得出子叶制备的原生质体优于悬浮细胞，并且原生质体的活性较高，平均为7.5×106个/g；悬浮细胞的产率也较高，但其活力比子叶低，平均为6.9×106个/g，完整率没有太大的差别。虽然悬浮细胞原生质体总量高于子叶分离的原生质体，但其原生质体活力产量却低于子叶，可能是由于悬浮细胞传代次数多，造成活性有所降低。

游离原生质体时，适宜的酶解条件因植物的种类不同有很大差异［12-14］。试验中酶液组成以2%纤维素酶+1%果胶酶为最佳。原生质体游离时酶解是关键，而酶解中酶的种类和浓度更为重要。以往试验多采用3种以上酶，而且酶解时间很长，一般在10 h以上［15-17］。试验中酶液组成以R-10纤维素酶2%+R-10果胶酶1%较合适，只采用2种酶，仅8 h就可得到大量高活力的原生质体。一般认为原生质体的分离，纤维素酶和果胶酶是必要的［18］，主要是纤维素酶和果胶酶更易接触细胞壁和原生质体间的果胶，从而使原生质体更易达到分离［19］。试验中随着酶解时间的延长，原生质体的数量也逐渐增加；酶解8 h便产生大量原生质体，其活力和完整率为最佳，随着酶解时间的继续延长，会出现活力和完整率下降的趋势。可能是由于失去细胞壁后，原生质体受到酶液的伤害［10］。研究中采用甘露醇作为渗透压调节剂，当甘露醇浓度较低时细胞膜容易破裂，造成原生质体的数量偏低；当甘露醇浓度较高时，原生质体则易失水而收缩影响正常的代谢活动，其生理活性就会降低［20］。甘露醇浓度为0.7 mol/L时得到的原生质体产量、活力及完整率最佳。酶液的pH对原生质体的产率和活力都有很大的影响，试验中酶液最适pH为5.5，太低或过高时，产量都不高。其原因是2种酶的活力受pH影响，纤维素酶的最适pH是5.5~6.0，果胶酶有效作用的pH是2.56。可能由于二者的互作效应，试验中酶液的最佳pH值为5.5。

试验结果表明，黄瓜子叶获得高质量的原生质体的最佳条件为：酶液组合2%纤维素酶+1.0%果胶酶，酶解时间8 h，酶液浓度0.7 mol/L，酶液pH 5.5。

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