离子束轰击对芦荟细胞壁结构的损伤效应

尧俊英 冯昕 李景原

摘要：利用扫描电镜、透射电镜方法，观察氮离子束注入对芦荟细胞壁结构的影响。扫描电镜观察结果显示，在离子注入剂量达1×lOl6N+/cm2时，叶片表面发现了离子束刻蚀的小洞。透射电镜半薄切片观察也发现离子束轰击后，芦荟叶片表皮的横切面都有不同程度被打烂的情况，初步认为是离子束轰击引起的刻蚀效应.这与扫描电镜的观察结果相一致。研究结果可为离子束介导转基因技术的研究提供参考。

关键词：离子束；芦荟；扫描电镜：透射电镜

中图分类号：Q336

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2014）03-0195-04

1986年我国科学家首先将离子注入技术作为一种新的辐射诱变手段引入水稻的诱变育种研究领域，表现出许多不同于其他电离辐射的特征[1]。在此基础上又开展了离子束介导外源基因转导工作，经过20多年的实践，离子束介导外源基因转化技术在水稻、小麦、棉花、烟草、西瓜等多种作物上取得成功[2]。但是目前，离子束与生物体相互作用机理仍存在较大的争议。在物理机制上，低能离子束在生物组织中的射程和相互作用过程中的动力学和运动学行为存在争议；在生命科学方面，如何在分子、细胞等层次说明注入离子对生物组织和生命过程的作用，离子注入诱变育种和介导转基因的理论等还不完善。无论是离子注入诱变，还是离子束介导转外源基因，离子束都必须穿透细胞壁后才能发挥作用。因此，如何阐明离子束诱变和转基因的机理对于离子束生物技术的发展具有重要意义[3-6]。

芦荟（Aloe）属百合科芦荟属多年生肉质常绿草本植物，含有多种药用成分。药理研究和临床试验表明，芦荟具有抗菌、抗病毒、抗辐射、提高人免疫机能等功能[7，8]，因而广泛应用于医药和化妆品工业。目前，离子束诱变技术研究集中在农作物育种方面，而在药用植物的研究方面还比较少见。笔者将离子束诱变技术应用于芦荟的诱变育种，取得了一定的效果。本实验以药用植物芦荟为研究材料，以lxl014、1 xl015、1×l016N+/cm2氮离子束轰击芦荟叶片，利用扫描电镜和透射电镜观察离子束轰击对芦荟细胞壁结构的影响，以期从生命科学的角度为离子束介导转基因等技术理论的发展提供参考，同时拓宽了离子束育种的应用范围[9，10]。

1材料与方法

1.1材料

实验材料选用库拉索芦荟（Aloe vera L.），购于郑州市植物园。选择长势良好，比较幼嫩的芦荟叶片作为氮离子束注入的材料。

1.2方法

1.2.1氮离子束注入芦荟叶片

取相同叶龄的芦荟叶片，进行氮离子注入处理，注入剂量分别为lxl014、lxl015N+/cm2和1×1016N+/Cm2，同时设真空对照品，无离子注入。

1.2.2芦荟叶片表面扫描电镜观察

将离子注入后的叶片切成5mm左右的小块，立即用3%的戊二醛固定2h以上。固定之后，用乙醇梯度脱水：300/0乙醇→500/0乙醇→700/0乙醇→85%乙醇→95%乙醇→100010乙醇（2次）→1/2乙醇+1/2二甲苯→二甲苯→1/2乙醇+1/2二甲苯→100%乙醇（洗净二甲苯）（每级脱水时间为2h，700/0时可停留过夜）[11]。脱水干燥之后，用JEOL、JEC-560型离子溅射仪溅射碳膜，用JEOL、JEC-1600型离子溅射仪溅射金膜，用JEOL、JSM-6700F型扫描电子显微镜观察、拍照[11-15]。

1.2.3芦荟叶片表皮横切面半薄切片观察

将离子注入后的叶片切成1mm左右的小块，用戊二醛前固定2h以上。戊二醛固定好以后，将材料取出放入盛有磷酸缓冲液的小瓶中，清洗3～4次，以彻底洗净戊二醛固定液。洗净后加入锇酸后固定，固定时间4～6h。材料固定好之后，用蒸馏水清洗3次以上，用1%的醋酸双氧铀染色1h，再用蒸馏水清洗两次。固定、染色之后的材料用500%、70%、80%、90%、100%丙酮梯度脱水，每级30min。脱水干燥后，将材料用Epon812树脂包埋，包埋块于36、45、60℃分别聚合12h。将所得的包埋块从模板中取出，放入盛有干燥剂的棕色瓶中保存[11]。

包埋块经修块之后，用Reichert-Jung超薄切片机切半簿切片，切片厚度为1～2μm，切片挑出放在洁净的载玻片上，于科迪KD-H烘片机上烘干，再用1%的亚甲基兰染色10min，染色结束后用蒸馏水冲洗干净，烘干，用Olympus BX -51显微镜观察并拍照[11，15]。

2结果与分析

2.1扫描电镜观察

从扫描电镜表面观察结果可以看出，芦荟表皮细胞形状清晰可见，呈四～六边形，如图1A所示，在叶的表面覆盖着一层厚厚的角质层，尤其是气孔器周围蜡质堆积现象明显，角质层的纹饰也比较规则，扫描电镜下，整个表皮细胞表面是比较平滑的（见图1B）。在低剂量氮离子束（lxl014 N+/cm2和1xl015 N+/cm2）注入后，芦荟叶片表面总体变化不大，如图1B所示，细胞表面依旧是比较平滑的。但是当注入剂量达到1×l016 N+/cm2，在芦荟叶片上发现了离子束刻蚀的痕迹以及小洞（见图1D、F），这与泰国清迈大学的L.D.Yu等的研究结果相似[l6]。从图1F中画出的标尺上可以看出，洞的直径大小达到了240nm左右，这个大小足以使外源DNA能够穿过。通过扫描电镜的观察，初步证实了离子束介导外源基因转移在理论上具有一定的可行性，为目前所开展的离子束介导转基因技术提供了一定的实验参考依据，但具体机理还有待于进一步深入的研究。

2.2半薄切片观察

透射电镜半薄切片观察结果显示，未经离子注入的对照组芦荟叶片表皮横切面都很光滑，如图2A和图2B所示，显微镜下观察到表皮细胞的横切面是一条光滑的曲线。而对离子注入过的芦荟叶片表皮的横切面的观察则发现，叶片表皮上出现了不同程度被打烂的情况，如图2C和图2D所示，显微镜下观察到表皮的横切面不再是一条光滑的曲线，已经不能够染上均匀的颜色。初步认为是离子束注入引起的刻蚀效应，这与前文中扫描电镜的观察结果相一致。

3结论与讨论

离子束是指一束具有一定能量的质量数小于或等于4的带电离子束，离子束注入技术是生物物理技术，具有生理损伤小、突变谱广和突变频率

图l芦荟叶片扫描电镜图谱

（A）、（B）对照组；（C）～（F）离子束轰击芦荟叶片表面扫描电镜观察

Fig.l

The picture of Aloe by scanning electron microscope

（A），（B）：The Aloe leaf surface of the control group under the SEM；（C）～（F）：The Aloe leaf surface treated with ion beam un-der the SEM

图2芦荟叶片半薄切片观察图

（A）、（B）对照组芦荟叶片的半薄切片（表皮横切面）观察；（C）、（D）离子束轰击后芦荟叶片透射电镜半薄切片（表皮横切面）观察

Fig.2

The picture of Aloe leaf semithin section by microscope

（A），（B） The observation of Aloe leaf epidermis transverse section of the control group； （C）， （D） The observation of Aloe leaf-epidermis trarnsverse section after ion beam bombardment高等特点。离子束与生物体的相互作用是我国具有独立知识产权的生物物理技术，我国科学家在20世纪80年代已经发现了离子束注入的生物效应，并将这一原理应用于植物诱变育种。到目前为止，已有十几项创新成果和一批具有重要价值的育种材料获得认定[2]。

实验通过扫描电镜和透射电镜的方法观察了离子束轰击对芦荟细胞壁结构的损伤效应，扫描电镜观察结果表明，低剂量离子束注入对芦荟叶片结构影响不大，但当注入剂量达到lxl016 N+/cm2时，则在叶片表面发现了离子束刻蚀的痕迹以及小洞，初步证实了离子束轰击对生物材料的刻蚀现象。离子束轰击后对芦荟叶表皮横切面的半薄切片观察也发现，对照组的表皮横切面都很光滑，而离子注入过的表皮的横切面则出现了不同程度被打烂的情况，进一步证实了离子束轰击引起的刻蚀效应。实验过程中，透射电镜的观察部分只做到了半薄切片的观察，后续的工作将通过透射电镜进行超薄切片的观察，以阐明离子束轰击对细胞器等结构的影响，为离子束诱变技术应用于药用植物的遗传育种提供一定的参考依据。

研究结果从理论上进一步证实了离子束介导转基因技术的可行性。但是，离子束诱变或转基因是一项非常复杂的生物学过程，其具体机理还有待于进一步深入的研究。目前开展的离子束生物工程技术较侧重于应用，其诱变及转基因的机理还没有阐明清楚，因此，在开展应用研究的同时，还应投入一定的精力于基础研究，阐明该技术的机理，从而使其更好地应用于生产。

参考文献（References）：

[1]余增亮，何建军，邓建国，离子注入水稻诱变育种机理初探[J]安徽农业科学（YU Zeng-liang， HE Jian-jun， DENG Jian-guo. Preliminary studies on the mutaqenic mechanism of theion implamtati on rice[J].Journal of Anhui Agricultural Sci-ence）， 1989， 39（1）：12-16.

[2]解继红，包金刚，徐柱，等.离子束对生物体的作用原理及应用[J].基因组学与应用生物学（XIE Ji-hong， BAO Jin-gang，XU Zhu，et al.The action principle of organisms by ion beamand their application[J]. Genomics and Applied Biology）， 2010，29（4）：761-767.

[3]韩建伟，余增亮低能离子对蕃茄果皮刻蚀与穿透作用的

研究[J].生物物理学报（HAN Jian-wei， YU Zeng-liang. Studyon etching and penetrating oflow energy ions into tomato peel[J].Acta Biophysica Sinica）， 1998，14（4）：757-761.

[4]VILAITHONG T，YU L D，ALISI C，et al.A study of low-en-ergy ion beam effects on outer plant cell structure for exoge-nous macromolecule transferring[J]. Surface and Coatings Tech-nology， 2000，128-129（7）：133-138.

[5]VILAITHONG T，YU L D，APAVATJRUT P，et al Heavy ioninduced DNA transfer in bioligical cells[J]. Radiation Physicsand Chemistry， 2004，71（3-4）：927-935.

[6]黄旭初，侯娟，刘效勇.模拟计算低能重离子注入植物种子的深度[J].核农学报（HUANG Xu-chu， HOU Juan， LIU Xiao-yong. Monte Carlo simulation of penetration range distributionof ion beam with low energy implanted in plant seeds[J]. Jour-nal of Nuclear Agricultural Sciences）， 2009，23（6）：976-980.

[7]中华人民共和国卫生部药典编辑委员会.中华人民共和国药典[M].北京：人民卫生出版社（Chinese PharmacopoelaCommission. Pharmacopoeia of the People's Republic of Chi-na[M]. Beijing： People Health Press）， 2010.

[8]YAMAMOTO M，MASAIT A K.Sugiyam Antrnflam matory active constituents of Aloe a-rborensces Millr[J].Agricultural Bi-ological Chemistry， 1991，55：1627-1629.

[9]尧俊英，薛建平，李景原，等.低能离子束注入芦荟茎尖的组织培养研究[J].中国中药杂志（YAO lun-ying， XUE Jian—ping，LI Jing-yuan，et al.The tissue culture study of low energyions into Aloe tip [J]. China Journal of Chinese MateriaMedica）， 2008，33（12）：1487-1489.

[10]尧俊英，王吉中，薛建平，等，氮离子注入对芦荟组培苗生理生化指标的影响[J].郑州轻工业学院学报（YAO Jun-ying，WANG Ji-zhong， XUE Jian-ping，et al.Effects of nitrogen ioninjection on physiological and biochemical indexes of Aloe tis-sue culture seeding[J]. Journal of Zhengzhou University of LightIndustry（Natural Science））， 2010， 25（5）：41-43

[11]付洪兰.实用电子显微镜技术[M]北京：高等教育出版社（FUHong-Ian. Practical Electron Microscope Technique[M]. Beijing：Higher Education Press）， 2004.10-58.171-182.

[12]李建军，李景原，朱命炜，等.3种芦荟属植物叶的表皮扫捕电镜观察及芦荟素含量的测定[J].西北植物学报（LI Jian-jun，LI Jing-yuan， ZHU Ming-hui， et al.Observation on epidermisof leaves by scanning electron microscope and the determination of contents of Aloin in three species of Aloe[J]. Acta Botani-ca Boreali-Occidentalia Sinica）， 2004，24（8）：1397-1401

[13]LIU Xue-yu， CUI Ye-long， CHEN Li-wen. Preliminary studyon biological effects of'ion implantation into wheat seeds[J]. ActaAgriculturae Nucleatae Sinica，1995，9（2）：125-128.

[14]唐洪涛，王峰，李伟名，等.y射线辐照与溶液协同预处理对玉米秸秆酶解产糖率及微观结构的影响[J].核农学报（TANGHong-tao， WANG Feng， LI Wei-ming， et al.Effect of y-raysirradiation and Alkali solution pretreatment on hydrolyzing en-zyme and microcosmic structure of corn straw[J]. Journal ofNudear Agricultural Sciences）， 2012，26（3）：535-542.

[15]BAE Chang-hyu， ABE Tomoko， MATSUYAMA Tomoki， et alRegulation of chloroplast gene expression is affected in ali，anovel tobacco Albino mutant[J]. Annals of Botany， 2001，88（4）：545-553.

[16]PRAKRAJANG K，SANGWIJIT K，ANUNTALABHOCHAI S，et al.Neutralized ion beam modication of cellulose membranesfor study of ion Charge effect on ion-beam-induced DNAtransfer[J]. Nuclear Instruments and Methods in Physics ResearchSection B，2012， 272（2）：382-385.