脐带血红细胞MCV和MCH筛查新生儿地中海贫血的可行性研究

李翔 尹爱华 江静波 杨杰 聂川 王俊平 梁志江 张小庄

摘要：探讨脐带血MCV（红细胞平均体积）和MCH（红细胞平均血红蛋白含量）筛查新生儿地中海贫血的可行性，确定MCV和MCH最佳临界值。采集来自广东省21个不同地区13396例新生儿脐带血样本。应用标准全自动血细胞分析仪对新生儿脐带血进行全血细胞分析，采用液相芯片技术对脐带血进行基因验证。应用统计学方法计算出灵敏度和特异度，使用ROC曲线（受试者特征工作曲线）确定MCV、MCH的最佳截断值。结果发现携带地中海贫血基因的脐带血中MCV、MCH值下降，它们可以作为新生儿地中海贫血的筛查指标。α-地中海贫血β-地中海贫血，以及αβ-复合型地中海贫血的截断值分别为104fl/34pg；ll0fl/36pg；104fl/33pg。根据我们的结果.MCV和MCH有较高的灵敏度和特异度。同时，应用MCV、MCH两项指标筛查不同类型的地贫患儿时，诊断符合率较高。此外，MCV、MCH的ROC曲线下面积较大，特异度和灵敏度高，筛查效果好。可以得出的结论：广东省新生儿地中海贫血发病率高，MCV和MCH应用于新生儿地中海贫血的早期诊断具有重要价值。

关键词：红细胞平均体积（MCV）；红细胞平均血红蛋白含量（MCH）；最近截断值；新生儿地中海贫血

中图分类号：R722.11

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2014）03-0241-05

地中海贫血，又称“海洋性贫血”和“珠蛋白合成障碍性贫血”，简称地贫，是一种隐性基因遗传病，可导致遗传性溶血性贫血，是全球分布最广、累积人群最多的一种单基因病[l]。目前诊断地中海贫血的金标准是基因检测，但由于基因检测方法繁琐、设备要求高、费用昂贵，基层单位无法有效开展基因诊断工作。目前国内外已有很多报道显示红细胞指标对于成人筛查地中海贫血具有很高价值并且技术也非常成熟[2～4]，如翁晓邓等指出MCH比MCV更稳定，应采用MCH法筛查α地贫[5]。丁高侬等综合分析MCH、MCV和RDW变化可以作为地中海贫血高发区计划生育服务站筛查地贫的初筛手段，此方法简便、经济、实用[6]。胡雪华等认为产前脐带血MCV、MCH的参考范围明显高于新生儿及成人，有必要建立参考范围；产前脐带血MCV、MCH检测可为α地贫临床诊断提供依据，MCH筛查α地贫优于MCV[7]。田鸾英等的研究表明MCV和红细胞脆性均可作为新生儿地贫诊断的有效指标，且MCV的诊断价值优于红细胞脆性[8]。本研究历时8个月在广东省21个地市采集新生儿脐带血13396份，用标准化全自动血细胞分析仪对新生儿脐带血进行分析。利用受试者工作特征曲线（简称ROC曲线），确定MCV、MCH的最合适截断值，从而探讨并验证脐带血MCV、MCH定量筛查新生儿地贫的应用价值。

1研究对象

广东省妇幼保健院2012年5月1日至12月31日选取全省21个地市的三甲及二甲医院，采集新生儿脐带血共13396例为研究对象。在进行地中海贫血产前诊断前，遵循“知情同意和知情选择”的原则，与重型地中海贫血高风险孕妇或其家属签署《地中海贫血产前诊断知情同意书》，以使其明确技术可能存在的风险和结果的不确定性。

2材料与方法

2.1仪器与试剂

标准全自动血细胞分析仪α（SIEMENS，德国）；离心机（Eppendorf，德国）；全血基因组DNA提取（厦门致善公司Lab-Aid 820自动核酸提取仪）；DNA测定仪（Nanodrop ND -2000 c）；超微量分光光度计（Nanodrop，美国）；PCR仪（ABI 2720，美国）；液相芯片检测仪（美国Luminex 200液相悬浮芯片系统）；全自动血细胞分析仪配套试剂（SIEMENS，德国）；全血基因组DNA提取试剂盒（厦门致善公司）；Luminex200液相悬浮芯片系统配套试剂（美国Luminex公司）；地中海贫血基因检测试剂盒（广州医科大学附属广东省妇儿医院研发）。

2.2样本采集

新生儿娩出后断脐时，用真空采血针采取新生儿脐带血2mL放人含有ACD抗凝剂的抗凝管中，将试管颠倒混匀5～8次，以使其充分抗凝，并在试管上做好标识，在2h内送检，若不能在2h内送检，需放2～8℃冰箱保存，保存时间不超过3d。

2.3检测方法

全血细胞分析全部采用标准血细胞分析仪，按仪器说明进行操作。新生儿脐血均提取DNA，使用厦门致善生物公司生产的磁珠法基因组DNA提取试剂盒和自动化仪器（Lab-Aid820）。地中海贫血基因使用广东省妇幼保健院实验室研发的地贫液相芯片检测。该地贫液相芯片技术已被证实具有很高灵敏度及特异度，且已获得中华人民共和国专利许可证（Pub：No：W0/2012/136070）。

2.4地中海贫血分型

WH01982年将地中海贫血定义为α类和β类珠蛋白肽链比例失衡所导致的血红蛋白病，临床表现为小细胞性、低色素性、溶血性和遗传性贫血，并且根据受累的珠蛋白肤链的类型分为α地贫、β地贫、γ地贫、δ地贫和δβ地贫等[9]。其中以α和β地贫最为常见，危害也最大。α地贫可以分为缺失型和非缺失型两大基因类型，缺失型α地贫：其分子基础主要是α珠蛋白基因大片段缺失；非缺失型α地贫：没有α基因的缺失，主要是由点突变所致。根据基因的缺失或突变情况及临床表现严重程度，可将α地贫分为静止型、轻型、中间型和重型（HbBart's胎儿水肿综合征）4种类型。β地贫的分类与α地贫相似，主要也分为非缺失型突变和缺失型突变。根据基因的缺失或突变情况以及临床表现把β地贫分为4种类型：静止型、轻型、中间型和重型。另外α地贫复合β地贫，两者同时存在的情况也十分常见[l0]。

2.5统计学方法

用SPSS17.0统计软件进行数据处理，采用系统U检验和ROC曲线分析

3结果

3.1正常新生儿与地贫基因携带新生儿脐带血红细胞指标的比较

研究对象为任一方为广东户籍的父母的新生儿脐带血13396例，其中α地贫基因携带者1571例（占11.73%），β地贫基因携带者500例（占3.73%），αβ复合型地贫基因携带者76例（占0.57%）。观察并记录全部研究对象的红细胞指标，其中无地贫基因携带的新生儿RBC的为3.67～4.81xl012/L，Hb为127.32～171.38L.MCV为99.27～115.45fl，MCH为32.87～37.67pg，MCHC为294.59～364.83L。α地贫基因携带的新生儿为1571例，RBC为4.06～5.38x1012/L，Hb为120.25～157.83L，MCV为84.36～103.96fl，MCH为26.42～32.96pg，MCHC为293.30～339.10L。β地贫基因携带的新生儿为500例，RBC的为3.72～4.96 xl012/L，Hb为129.44～168.02L，MCV为96.59～112.93fl，MCH为32.06～36.62pg，MCHC为307.87～349.49L。αβ地贫基因携带的新生儿为76例，RBC的为4.19～5.75xl012/L，Hb为124.06～163.78L，MCV为83.80～103.54fl，MCH为26.17～32.15pg，MCHC为297.03～326.81L。正常新生儿与地贫新生儿红细胞指标分布结果见表l所示。

由表1可知，地贫基因携带的新生儿的红细胞指数表现为MCH和MCV降低，因此在RBC、Hb、MCV、MCH、MCHC 5项指标中，我们选取MCV和MCH作为新生儿地贫的首选筛查指标进行分析。

3.2 MCV和MCH筛查结果

利用MCV和MCH筛查新生儿α地贫的灵敏度分别为84.8%和90.3%，特异度为68.9%和74.6%，截断值是104fl和34pg；筛查新生儿β地贫的灵敏度分别为80.4%和81.6%，特异度为31.2%和34.6%，截断值是110fl和36pg。筛查新生儿αβ复合型地贫的灵敏度分别为81.6%和90.8%，特异度为68.9%和87.8%，截断值是104fl和33pg。筛查结果见表2、表3，MCV、MCH法筛查地中海贫血结果组间具有明显差异，P<0.05。

3.3利用ROC曲线分析红细胞指标的诊断价值

利用ROC曲线，分析红细胞指标RBC、Hb、MCV、MCH、MCHC的诊断价值，以新生儿脐带血基因诊断为金标准，将检出带有地贫基因的新生儿与未检出地贫基因携带的11249例正常新生儿对照计算出灵敏度和特异度，以灵敏度为纵坐标代表真阳性率，1一特异度为横坐标为假阳性率，作图绘制ROC曲线，分别计算5个红细胞指标ROC曲线下面积。结果见图1（A、B、C）。

4讨论

由本研究调查结果可知，广东地区13396例新生儿中检出地贫2147例，地贫总携带率为16.0%。如此高的检出率表明地贫筛查对当地人口的优生优育计划十分必要。早期准确的新生儿筛查试验能有效降低新生儿发病率和死亡率[11]。意大利、塞浦路斯等欧洲地贫高发国家，按照地贫筛查与产前诊断的结果等制定了地贫预防计划，并在广大人群中有效实施，成功降低了地贫患儿的出生率[12]。地中海贫血是一种隐性基因遗传病，临床上绝大多数地中海贫血基因携带者是无症状的，但他们常表现出一些异常改变的血液学表型特征，如小细胞低色素症、MCV和MCH含量发生变化，这是我们有效筛查地中海贫血基因携带者的指标[13，14]。血液学表型分析主要包括红细胞指标（如RBC计数、MCV和MCH等）的测定和血红蛋白分析（包括异常血红蛋白检测、Hb A和Hb F定量测定），MCV和MCH对于诊断地中海贫血是有帮助的[15]，必要时辅以铁代谢状态的分析。本研究通过分析MCV和MCH的ROC曲线的最佳截断值来筛查新生儿地中海贫血，结果表明以此两项作为地贫的初步筛查指标是简单可行的，在没有条件开展血红蛋白电泳及基因检测的基层医疗机构中容易开展，同时受检人群经济压力小，可大规模推广。

地中海贫血症具有鲜明的地域与人群差异，有文献指出地中海周边国家、非洲与东南亚地区高发地贫，且地贫基因的新生儿红细胞指数MCV、MCH和MCHC均比正常新生儿低[16]。该结果虽不能确定这些红细胞指标是地中海贫血筛查的特异性指标，但可为其初步筛查提供参考。本研究结果指出红细胞指标中，地贫各组与正常组比较以MCV和MCH值最有临床意义，α地贫、β地贫和α/β复合型地贫的MCV和MCH值均低于正常组数据；携带有地贫基因的新生儿红细胞指数结果为MCV、MCH偏低。该结果论证了MCV、MCH是地中海贫血筛查中具有参考意义的红细胞指数。另外，值得注意的是，虽然地贫Hb水平在正常范围内，但RBC与Hb的比值明显大于正常新生儿的比值。这与陈和平[17]、尹卫东[18]的调查数据基本相符，而与黄邵良[19]的数据有差异。造成这种差异的原因是否为父母异地跨省通婚，仍有待研究。

平均红细胞体积（MCV）增多见于大细胞性贫血，减少见于小细胞性低色素性贫血。林庆芳等[20]取无Bart's的正常脐带血30份和含Bart's的脐带血53份，ROC曲线结果显示，MCV的ROC曲线下面积为0.8755时，以曲线转弯点98.3fl为最佳诊断截断值，灵敏度和特异度分别为83.02%和96.67%，其中对标准型α地中海贫血诊断灵敏度高达96.55%。当MCV曲线最佳截断值为104fl时，灵敏度和特异度为84.8%和68.9%，本研究结果与林庆芳等的数值基本相符。平均红细胞血红蛋白量（MCH），指每个红细胞内所含血红蛋白的平均量。本研究结果MCH最佳截断值为34pg，当MCH<34pg时，其诊断灵敏度和特异度分别为90.3%和74.6%。这与翁晓邓等[5]用MCH筛查α地中海贫血的结论是一致的。本研究中β地贫MCV、MCH的特异度偏低，这可能是由于人类II号染色体中含有两个β珠蛋白基因，其遗传方式符合孟德尔遗传规律但其病理具有高度的异质性[10]。大量研究证实，β地贫基因突变类型及频率分布具有明显的种族特征及地域差异[21]。β地贫的分子遗传学机制有高度的异质性，广东地区β地贫的分子遗传机制与中国其他地区相比有差别[22]。通过对福建省11234例新生儿脐带血地中海贫血基因分析，表明β一地中海贫血基因突变在不同地区是复杂的，表现出明显的异质性[23]。

有研究指出地中海贫血筛查中，最具参考意义的指标为MCV与MCH[24]，除少数静止型外，地中海贫血均表现为MCV和MCH降低的小细胞低色素症表型，排除缺铁性贫血后，则按地中海贫血诊断基本流程进行下一步分析与诊断。本研究中结果也显示应用MCV、MCH作为地中海贫血筛查指标时，针对不同分型的各类地贫，诊断符合率较高，但脐带血常规作为简便易行的筛查方法仍存在例如部分静止型地中海贫血漏检等不足，出现此结果的原因可能是与某些静止型的地贫患儿不表现为小细胞低色素的血液学表型有关，这为进一步进行血红蛋白电泳及基因筛查提供了依据。

根据以上统计数据，我们认为MCV、MCH可以建立最佳截断值的参考范围，以作为新生儿地贫的初步筛查试验，及早发现地中海贫血患儿，减少地中海贫血基因携带者互相婚配出生重症地贫患儿的机会。抽取脐带血是一种既对新生儿无创伤又简便、易行、快速的方法。用脐带血MCV和MCH作为新生儿地贫初筛的指标，可以在广大基层单位推广，有着非常重要的临床价值。

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