转融合基因CrylAb/Ac水稻稻杆对泥鳅蛋白水解酶和乙酰胆碱酯酶活性的影响

李菲 刘雨芳 孙远东 谭树华 肖璐 刘文海 莫书银 桂芳艳

摘 要：为探索转Bt抗虫水稻对泥鳅的毒性作用，采用水体中添加不同浓度（10.50、100、200mg/L）的转融合基因CrylAb/Ac水稻华恢1号（HHl）稻杆粉饲养泥鳅，非转基因亲本明恢63（MH63）作对照，不加稻杆粉为空白对照，分析了对泥鳅蛋白水解酶、乙酰胆碱酯酶（AChE）的影响。研究发现：经4个浓度处理后，泥鳅的胃蛋白水解酶、肠蛋白水解酶和脑AChE、肝脏AChE、肌肉AChE与对照组泥鳅相比均无显著差异（n=3，P>0.05）。高浓度（200mg/L） HH1、MH63组泥鳅胃蛋白水解酶与空白对照相比均显著降低（n=3，P<0.05）；低浓度（1Omg/L）HH1组泥鳅肝脏AChE与空白对照差异显著（n=3，P<0.05）；不同浓度HH1、MH63稻杆粉对泥鳅的肠蛋白水解酶、脑AChE和肌肉AChE均无显著影响（n=3，P>0.05）。结果表明：HH1水稻稻杆粉对泥鳅的消化道蛋白酶和乙酰胆碱酯酶没有影响，而水体中高剂量的HH1或MH63稻杆粉均会降低泥鳅胃的消化能力。

关键词：转融合基因CrylAb/Ac水稻；泥鳅；蛋白水解酶；乙酰胆碱酯酶

中图分类号：Q142.8

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2014）03-0189-06

转Bt基因抗虫水稻通过靶标害虫取食杀虫晶体蛋白，在昆虫碱性肠道内溶解，与中肠膜受体结合，引起细胞溶解，导致昆虫停止进食而致死的方式[1]，对二化螟（Chilo suppressalis）、三化螟（Try-Poryza，incerlulas）和稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocismedinalis）等鳞翅目害虫具有高度特异抗性，其应用能有效降低水稻受虫害侵袭造成的损失，减少化学杀虫剂带来的环境问题[2-4]。我国相继成功培育“克螟稻”和“华恢l号”等转Bt基因抗虫水稻，“华恢1号”于2009年获得农业部批准安全证书（农基安证字（2009）第072号），极有可能有力推动转基因抗虫水稻商业化种植，与此同时，由此可台能引发的生态安全问题也再次成为公众关注的热点。

大量的田间调查显示，转Bt抗虫水稻对非靶标害虫白背飞虱（Sogatella furcifera）、黑尾叶蝉（Nephotettix cincticeps）的种群发生动态没有明显影响[5，6]；对食虫沟瘤蛛（Ummeliata insecticeps）、黑肩绿盲蝽（Cyrtorhinus lividipennis）等捕食性天敌的物种丰富度和多样性[7，8]、稻田节肢动物群落的物种组成及丰富度、多样性[9，10]没有显著影响，但寄生蜂等天敌的数量明显降低[11，12]。转Bt抗虫水稻对土壤动物的安全性评价也有大量报道，如转Bt抗虫水稻种植后弹尾虫的种类与丰富度没有受到明显影响[13]；而田间土壤跳虫总量受到一定程度的影响，但对其群落多样性、均匀度和物种丰富度影响不显著[14]，土壤线虫数量及植物寄生线虫成熟度在转Bt抗虫水稻短期种植下没有显著影响[15]。已有文献表明转Bt抗虫水稻的安全性评价多偏向于对地上或土壤生物的研究，缺乏对稻田水生生物与水体生态环境的毒性作用的评价研究，不能全面反映转基因水稻的生态安全性。

在我国南方“稻一鱼”互作的生态农业模式中，泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus），作为水稻田中主要的淡水鱼，通过觅食、潜穴等游动行为对稻田水生生态系统的结构与功能起到良好的改善作用[16]：同时，泥鳅对水体不良胁迫反应灵敏，如吴若菁等研究了SO2衍生物、杀虫剂、苏丹红Ⅲ等对泥鳅的急性毒性、遗传损伤和生理酶活性的影响[17～19]，均显示泥鳅在评价水体污染物对水生生物的毒理效应中可作为良好的指示生物。因此，本研究以泥鳅为指示生物，以转融合基因CrylAb/Ac水稻华恢1号及其对应亲本为实验材料，基于室内调控试验，开展转基因水稻稻杆粉对泥鳅的消化能力、神经传递的致害性比较研究，以期评价转Bt抗虫水稻秸秆物对泥鳅生理生化功能的影响，为进一步了解转Bt抗虫水稻对鱼类的影响提供科学依据。

1材料与方法

1.1供试水稻与稻杆取样

试验水稻种为转融合基因CrylAb/Ac水稻华恢1号（简称HH1），及其亲本对照明恢63（简称MH63）。

2012年6月，在湖南省湘潭市湖南科技大学国家农业部重大专项实验基地内，将试验田分成6块等面积小区，转Bt水稻HH1及其亲本MH63交替种植，各设3个重复。种植期间不施用化学杀虫剂与除草剂，其余水肥按常规农事操作与管理。于水稻成熟期（10月），随机选取不同品种稻株，去除稻穗，留下水稻植株远根处10cm茎干，保鲜袋分装，带回实验室，晾干粉碎，制成稻杆粉，-20℃冷藏备用。

1.2供试泥鳅

泥鳅购自湖南省湘潭市润田水产养殖有限公司，杀菌消毒后，于水族箱（70cmx65cmx50cm）内驯养，用水为充分曝气除氯（1d）的自来水，投喂饲料购自湖南省湘潭市润田水产养殖有限公司，饲料主要成分为粗蛋白（340/0）、粗纤维（17%）、灰分（17%）、食盐（4%）、总磷（2.2%）、钙（4%）、赖氨酸（1.5%）、蛋氨酸（0.2%）、水分（lO%）等。

1.3泥鳅饲喂设计

挑选健康活跃、体表无损伤的规格泥鳅45尾，测得初始平均体长为（7.69±0.08）cm，平均体重为（1.70±0.07）g，随机分成9组，每组5个重复，于容积1L的烧杯中单尾饲养（盛充气24h自来水800mL），加HH1稻秆粉为试验组（4组），加MH63稻秆粉为对照组（4组），1组不添加任何稻杆粉为空门对照。

泥鳅饲养于人工气候室内（100d），温度（23±1）℃，光周期（10L：14D）。期间每天定时换水，添加稻杆粉并喂食，投饵量为泥鳅初始体重的4%.根据国家渔业水质标准GB11607-89，渔业标准悬浮物质<10mg/L，稻杆粉设4个浓度，分别为10、50、100、200mg/L。

以水体pH和溶氧量（DO）为指标，测定了试验用水在投放稻杆粉饲养泥鳅24h始末的理化性质.酸碱度测定采用PH-033 waterproof Pen-type pH Meter，溶解氧含量测定采用碘量法（表1）。

1.4酶液制备与酶活性测定

饲养试验结束后，活体解剖泥鳅，取其脑、肝脏、肌肉、胃和肠组织，生理盐水冲洗，滤纸吸干、称重，进行粗酶液制备。胃和肠组织按照质量体积比1：8加人生理盐水（4℃），冰浴匀浆，匀浆液静置1h后（4℃），以7000r/min在4℃下离心20min，取上清液作为蛋白水解酶待测液。脑、肝脏和肌肉按照质量体积比1：10加入pH8.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液，冰浴匀浆，匀浆液于高速冷冻离心机上以10000r/min离心30 min（4℃），取上清液作为乙酰胆碱酯酶待测液。

蛋白水解酶活性f201测定采用福林一酚试剂法，酶活性定义为每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸为一个蛋白酶活力单位。乙酰胆碱酯酶活性[21]测定采用Ellman法，酶活力定义为每毫克脑（肝脏、肌肉）组织每分钟水解底物的摩尔数。

1.5数据分析

应用SPSS13.0统计软件，经Shapiro-Wilk和Levene对数据进行正态性及方差齐性检验后，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较平行组间转基因水稻品种和亲本对照泥鳅酶活性的差异。运用Duncan's多重检验法分析每一品种水稻不同稻杆粉浓度处理组与空白对照之间的差异显著性。

2结果

2.1胃蛋白水解酶

经两个品种不同浓度的稻杆粉喂养后，泥鳅的胃蛋白水解酶均随稻杆粉浓度增加明显降低，但HH1与MH63平行组间没有显著差异（表2）。10mg/L与200mg/L稻杆粉处理后，HH1组泥鳅胃蛋白水解酶略高于MH63（n=3，P>0.05）；50mg/L、100mg/L稻杆粉处理后泥鳅胃蛋白水解酶均略低于对照MH63 （n=3，P>0.05）。而添加HH1、MH63稻杆粉后，泥鳅的胃蛋门水解酶均不同程度地低于空白对照，其中，高浓度（200mg/L）HHl与MH63组泥鳅均显著低于空白对照（n=3，P<0.05）（图1）。

图1 HH1稻杆粉对泥鳅胃蛋白水解酶的影响

图中数据标注为平均值±标准误（n=3）；不同小写字母表示同一品种稻杆粉的不同浓度处理之间的差异显著（P<0.05）。图2—5同。

Fig.l Effects of HHl straw powder on activity of pro-teolytic enzyme in stomach of M.anguillicaudatus

Bar charts （x±Sx） with different lowercase letters mean thesignificant difference in vanous concentration of the samerice straw powder（P<0.05）. Same with Fig.2～5。

2.2肠蛋白水解酶

与对照MH63相比，不同浓度的HH1稻杆粉处理后，泥鳅的肠蛋白水解酶没有显著变化（表2）。其中，10mg/L、50mg/L HH1组略低于MH63（n=3，P>0.05）；100mg/L、200mg/L HH1组略高于MH63（n=3，P>0.05）。与空白对照相比，HH1组与MH63组泥鳅的肠蛋白水解酶均随稻杆粉浓度增加而逐渐降低，但差异不显著（n=3，P>0.05）（图2）。

图2HH1稻杆粉对泥鳅肠蛋白水解酶的影响

Fig.2

Effects of HHl straw powder on activity of prote-olytic enzyme in intestine of M. anguillicaudatus

2.3脑部乙酰胆碱酯酶

10mg/L HH1组泥鳅脑部的AChE活性略低于对照MH63，但无显著差异（n=3，P>0.05）；中高浓度（50、100、200mg/L）HHl组泥鳅脑部AChE活性均略高于MH63，无显著差异（n=3，P>0.05）（表2）。而经不同浓度HH1、MH63稻杆粉处理后，泥鳅脑部的AChE活性均略高于空白组，但没达到显著差异（n=3，P>0.05）（图3）。

图3 HH1稻杆粉对泥鳅脑部乙酰胆碱酯酶的影响

Fig.3 Effects of HHl straw powder on activity of AChEin brain of M.anguillicaudatus

2.4肝脏乙酰胆碱酯酶

从图4可以看出，不同浓度的HH1稻杆粉对泥鳅肝脏的AChE活性与MH63相比没有显著影响（表2），且HH1组与MH63组泥鳅肝脏AChE活性变化趋势相似，均随稻杆粉浓度增加而逐渐降低且始终高于空白对照，其中，10 mg/L HH1组显著高于空白组（n=3，P<0.05）。

图4 HH1稻杆粉对泥鳅肝脏乙酰胆碱酯酶的影响

Fig.4

Effects of HHl straw powder on activity of AChEin liver of M.anguillicaudatus

2.5肌肉乙酰胆碱酯酶

与MH63组相比，4个浓度水平的HH1稻杆粉处理对泥鳅肌肉AChE活性没有显著影响（表2）。经10、50mg/L稻杆粉处理后，HH1组泥鳅肌肉AChE活性不同程度地高于对照MH63 （n=3，P>0.05）；而100、200mg/L HH1组略低于MH63组（n=3，P>0.05）。HH1组、MH63组与空白对照均无显著差异性（n=3，P>0.05）（图5）。

图5 HH1稻杆粉对泥鳅肌肉乙酰胆碱酯酶的影响

Fig.5

Effects of HHl straw powder on activity of AChEin muscle of M.anguillicaudatus

3讨论

3.1转Bt水稻对泥鳅蛋白水解酶的影响

泥鳅属杂食性鱼类，水体中适度的稻杆粉可增加泥鳅食源的丰富度促进取食，蛋白水解酶的主要功能是将食物中的蛋白质分解为小的肽片段，其活性高低可直接影响动物的生长状况[22]。实验结果表明，稻杆粉浓度相同时，HH1水稻对泥鳅的胃、肠蛋白水解酶与MH63相比没有显著影响，但均随稻杆粉浓度的增加呈下降趋势，说明泥鳅的消化道蛋白酶活性与稻杆粉品种没有直接关联，而受浓度的影响。

注：表中F值为组间均方与组内均方之比，表示F检验水平。P值代表显著性差异水平，P>0.05时，表示HH1组均数与MH63组均数之间无显著性差异。

Notes：Values of F in the table shows the analysis of variance level， for the ratio of the groups mean squareand within group.Values of P represents the level of significant difference， P>0.05 means no significant dif-ference belween the HHl group and MH63 group。

有胃鱼中胃是主要的消化器官，本实验中泥鳅的胃蛋白水解酶活性远远高于肠蛋白水解酶，这与Ana等对鱼类蛋白酶活性的研究结果一致[23～25]。少量的稻杆粉进入泥鳅胃部，胃腺分泌蛋白水解酶、纤维素酶、淀粉酶等消化酶促进食物的分解，当杂食性鱼类取食植物性食物时淀粉酶分泌较多，因此试验中低浓度处的胃蛋白水解酶活性均略低于空白对照。但大量的稻杆粉会使水体pH和溶解氧等环境恶化，且较多的悬浮物会阻碍泥鳅的呼吸与滤食，直接影响泥鳅的正常取食与蛋白酶活性，使得高浓度组泥鳅胃蛋白水解酶活性显著降低。由于稻杆粉经胃部分解后进入肠道的含量较少，因此HH1或MH63组泥鳅肠蛋白水解酶均受影响程度较弱。总之，在本实验设定的稻杆粉浓度水平内，相同浓度的HH1与MH63组间泥鳅胃蛋白水解酶、肠蛋白水解酶没有显著差异。

3.2转Bt水稻对泥鳅乙酰胆碱酯酶的影响

郭文娟用转CrylAb/Ac基因水稻茎干饲喂靶标害虫大螟后其体内AChE活性显著降低[26]，周颖研究表明转CrylAb基因水稻对蜘蛛体内AChE活性没有影响[27]，肖能文用CrylAc蛋白人造土壤处理赤子爱胜蚓也表明对其AChE活性没有影响[28]。本实验结果表明，水体添加10～200mg/L稻杆粉后泥鳅脑、肝脏和肌肉的AChE酶活性与非转基因对照无显著差异。

乙酰胆碱是促进突触传导的主要神经递质，由轴突末梢释放后穿过突触间隙引起受体产生动作电位，AChE可将其水解为胆碱和乙酸，终止突触传递，保证生物体神经信号的正常传导[29]。AChE易受不良环境影响，Jebali等研究杀虫剂、久效磷对鲫鱼、罗非鱼体内AChE活性的结果表明AChE可灵敏反映生物体对环境胁迫的响应[30，31]，Seok用硫丹处理泥鳅后，检测其各项生理指标也表明AChE是良好的指示酶类[32]。本实验中HHl.MH63组泥鳅的脑AChE活性均略高于空白组，且MH63组脑AChE活性随稻杆粉浓度的增加而降低，说明泥鳅神经末梢对悬浮稻杆粉及水体环境改变的刺激反应敏锐，可引起神经兴奋促进脑部AChE释放。

肝脏的主要功能是解毒与代谢，当遭受不良胁迫时，即表现出灵敏的应激性与防御性。实验中泥鳅肝脏AchE活性均随稻杆粉浓度增加而下降，表明稻杆粉对肝脏AChE活性呈抑制效应，与稻杆粉浓度呈剂量一效应关系。此外，实验检测的AChE活性大小在泥鳅体内表现为：脑>肌肉>肝脏，证明了脑是中枢神经系统的主要部分，其调节和控制机体适应外界变化的灵敏度高于躯体神经和内脏神经，这与Reddy研究鲤鱼不同组织AChE活性的结果一致[33]。

本研究表明转融合基因CrylAb/Ac水稻HH1对泥鳅的蛋白水解酶和乙酰胆碱酯酶没有明显影响，而高剂量的转基因水稻或非转基因水稻稻杆粉均会影响泥鳅的消化能力与神经调节功能。本实验只对饲养100d后的泥鳅进行了酶活性检测，未能反映酶活性变化动态，研究也是在严格控制实验条件下进行的，但转Bt抗虫水稻大田种植及稻杆还田后是否对泥鳅有影响，有待进一步开展相关的连续性动态实验，以期全面了解转Bt水稻对水生动物的影响。

致谢：华中农业大学林拥军教授为本项目提供稻种，特此感谢！参考文献（References）：

[l]BRAVO A，CILL S S，SOBERQN M. Mode of action of Bacil-lus thuringiensis Cry and Cyt toxin and their potential for in-sect control[J]. Toxicon， 2007，49（4）： 423-435.

[2]李志毅，隋贺，徐艳博，等.转CrylAb和CrylAe融合基因型抗虫水稻对田间二化螟和大螟种群发生动态的影响[J]生态学报（LI Zhi-yi， SUI He， XU Yan-bo，et al.Effects of in-sect-resistant transgenic Bt rice with a fused CrylAb+CrylAegene on population dynamics of the stem borers， Chilo sup-pressalis and Sesamia inferens， occumng in paddy field[J].Acta Ecologica Sinica）， 2012， 32（6）： 1783-1789.

[3]XU X L，HAN Y，CAI W L，et al.Field evaluation of effects oftransgenic cryIAb/crylAc， crylC and cry2A rice on Cnaph-alocrocis medinalis and its arthropod predators[J]. Science ChinaLife Science， 2011， 54（11）： 1019-1028.

[4]COHEN M B，GOULD F，BENTUR J S Bt rice： practicalsteps to sustainable use[J]. International Rice Research， 2000，25（2）： 4-10.

[5]隋贺，李志毅，徐艳博，等，广西兴安转Bt水稻大田两迁害虫发生动态[J]应用生态学报（SUI He， LI Zhi-yi， XU Yan-bo，et al. Occurrence dynamics of migratory pest msectsCnaphalocrocis medinalis and Sogatella furcifera in transgenicBt rice field in Xing'an County of Guangxi Province[J]. ChineseJournal of Applied Ecology）， 2011， 22（11）： 3021-3025.

[6]CHEN M.YE C Y，LIU Z C，et al.Field assessment of the ef-fects of transgenic rice expressing a fused gene of crylAb andcrylAc from Bacillus thuringiensis Berliner on nontarget plan-thopper and leafhopper populations [J]. Environmental Ento-mology， 2006， 35（1）： 127-134.

[7]TIAN J C.LIU Z C，CHEN M， et al.Laboratory and field as-sessjnents of prey-mediated effects of transgenic Bt rice onUmmeliata insecticeps（Araneida： Linyphiidae）[J]. Environmen-tal Entomology， 2010， 39（4）： 1369-1377.

[8]CHEN M，LIU Z C，YE G Y，et al.Impacts of transgeniccrylAb rice on non-target planthoppers and their main preda-tor Cyrtorhinus lividipennis（Hemiptera： Miridae）-A case studyof the compatibility of Bt rice with biological control [J]. Bio-logical Control， 2007， 42（2）：242-250.

[9] 刘雨芳，尤民生，王锋，等.转crylAc/sck基因抗虫水稻对稻田捕食性节肢动物群落的影响及生态安全评价[C]//成卓敏.农业生物灾害预防与控制研究.北京：中国农业科学技术出版社（LIL Yu-fang， YOU Min-sheng， WANG Feng， et al.Ef-fect of insect-resistant crylAc/sck transgenic rice on the com-munities of predatory arthropods in paddy fields and its evalu-ating of ecological safety[C]// CHENG Zhuo-min. Disaster pre-vention and control of agricultural biotechnology research.Beijing： China Agricultural Science and Technology Press）2005.24-31.

[10]胡奇勇，郑宇.张晓俊，等福建省转基因抗虫稻田节肢动物群落多样性研究叨.中国生态农业学报（HU Qi-yong， ZHENYu. ZHANC Xiao-jun，et al.Effect of pest resistant transgemerice on arthropod community diversity in Fujian Province[J].Chinese Journal of Eco-Agriculture）， 2007， 15（4）：120-123.

[11]刘志诚，陈洋，田俊策，等，转crylAb基因粳稻对稻田节肢动物群落的影响[J].生物安全学报（ LIU Zhi-cheng， CHENYang，TIAN Jun-ce， et al.Impact of transgenic crylA 6 japon-ica rice on the arthropod community of rice paddies in China[J]. Journal of Biosafety）， 2011， 20（1）：69-76.

[12]刘雨芳，贺玲，汪琼，等.转crylAc/sck基因抗虫水稻对稻田寄生牛蜂群落影响的评价[J].昆虫学报（LIU Yu-fang， HE Ling，WANG Qiong， et al.Evaluation of the effects of insecet-resis-tant crylAc/sck transgenic rice on the parasitoid communitiesin paddy fields[J]. Acta Entomologica Sinica）， 2006， 49（6）：955-962.

[13]BAI Y Y，YAN R H，YE G Y，et al.Effects of transgenic riceexpressing Bacillus thuringiensis CrylAb protein on ground-dwelling collembolan community in postharvest seasons[J]. En-vironmental Entomology， 2010， 39（1）：243-251.

[14]祝向钰，李志毅，常亮，等，转Bt水稻土壤跳虫群落组成及其数量变化[J].生态学报（ZHU Xiang-yu， Ll Zhi-yi，CHANGLiang，et al.Community structure and abundance dynamics ofsoil collembolans in transgenic BL rice paddy fields[J]. Acta Eco-logica Sinica）， 2012， 32（11）：3546-3554.

[15]戚琳，陈法军，刘满强，等三种转Bt水稻短期种植对土壤微生物生物量和线虫群落的影响[J].生态学杂志（QI Lin， CHENFa-jun， LIU Man-qiang，et al.Effects of short-term plantingof three transgenic Bt rice lines on soil microbial biomass andsoil nematode assemblage[J]. Chinese Journal of Ecology）， 2013，32 （4）：975-980.

[16]孙刚，房岩，胡佳林，等泥鳅对稻田土壤动物的扰动效应[J].

生态与农村环境学报（SUN Cang， FANG Yan， HU Jia-lin，etal.A preliminary study on bioturbation effects of Misgurnusanguillicaudatus on soil animals in paddy field[J]. Journal of E-cology and Rural Environment）， 2011，27（1）：100-101.

[17]吴若菁，陈奋飞，庄捷，等SO2的衍生物对泥鳅的急性毒性和染色体损伤研[J].水生生物学报（WU Ruo-jing， CHEN Fen-fei， ZHUANG Jie， et al.SO2 derivative to Misguraus anguilli—caudatus of acute toxicity and chromosome damage research[J].Acta Hydrobiologica Sinica）， 2007，31（4）：585-589.

[18]李娟，陈洁文，甘居利，等.三氯杀螨醇对泥鳅血清GST和AchE活力的影响[J].生态毒理学报（LI Juan， CHEN Jie-wen，CAN Ju-li， et al.Effects of dicofol on activities of GST andAChE in blood serum of Loach（Misgurnus anguillicaudatus）[J].Asian Journal of Ecotoxicology）， 2011， 6（5）：551-556.

[19]常重杰，王君，肖静，等，苏丹红Ⅲ对泥鳅的急性毒性、遗传及生理毒性研究[J].水生态学杂志（CHANG Zhong-jie， WANGJun， XIAO Jing，et al.The acute toxicity， genetics toxicity andphysiology toxicity of sudan redⅢon Misgurnus anguillicau-datus[J]. Journal of Hydroecology）， 2012，33（4）：113-116.

[20]黄小燕，吴天星，李军，等，鮸鱼消化酶活性的研究[J].水利渔业（HUANG Xiao-yan， WU Tian-xing，LI Jun，et al.Re-searches on digestive enzyme activity of Miichthys miiuy[J]. Re-servoir Fisheries）， 2006，26（4）：86-87.

[21]ELLMAN G L，COURTNEY K D，ANDRES V，et al.A newand rapid colorimetric determination of acetylcholinesteraseactivity[J]. Biochemical Pharmacology， 1961，7（2）：88-95.

[22]DABROWSKI K，GLOGOWSKI J.Studies on the role of ex-ogenous proteolytic enzymes in digestion processes in fish[J]Hydrobiologia，1977，54（2）：129-134.

[23]RODILES A，SANTIGOSA E，HERRERA M，et al.Effect ofdietary protein level and source on digestive proteolytic en-zyme activity in juvenile Senegalese sole， Solea senegalensisKaup 1850[J]. Aquaculture International， 2012，20（6）：1053-1070

[24]侯风霞，张健东，叶富良，等.饥饿和再投喂对尼罗罗非鱼蛋白酶活性的影响[J]..广东海洋大学学报（HOU Feng-xia，ZHANG Jian-dong， YE Fu-liang，et al.Effects of starvationand refeeding on protease activity of Oreochromis niloticus[J].Journal of Cuangdong Ocean University）， 2007，27（4）：11-14.

[25]乔秀婷，张美婷，宋学君，等，乌鳢蛋白消化酶活性的研究[J]南开大学学报（QIAO Xiu-ting， ZHANG Mei-ting， SONGXue-jun，et al.Study on proteinase activity of Ophiocephalusargus[J]. Acta Scientiarum Naturalium Universiatis Nankaien-sis）， 1999，32（2）：121-123.

[26]郭文娟转crylAb/crylAc基因水稻对大螟的生物学及主要酶系的影响[D]武汉：华中农业大学硕士学位论文（GUO Wen-juan. Effects of transgenic crylAb/crylAe rice on the biology and main enzymes in the pink stem borer， Sesamia inferens[D]Wuhan： Huazhong Agricultural University）， 2012.6.

[27]周颖，魏宝阳，王智，等.CrylAb蛋白在蜘蛛体内的富集及对蜘蛛相关酶活性的影响[J].湖南农业科学（ZHOU Yin， WEI Bao-yang， WANG Zhi，et al.Bioaccumulation of CrylAb pro-tein in spider and its impacts on activities of relational en-zymes of spider[J]. Hunan Agricultural Sciences）， 2013，（7）：1-3.

[28]肖能文，戈峰.刘向辉.Bt毒蛋白CrylAc在人造土壤中对赤子爱胜蚓毒理及生化影响[J].应用生态学报（ XIAO Neng-wen，GE Feng， LIU Xiang-hui. Effects of Bt toxin CrylAe on biochemical responses of Eisenia fetida in an artificial soil[J]Chinese Journal of Applied Ecology）， 2005， 16（8）：1523-1526.

[29]SHAW B P.PANICRAHI A K.Brain AChE Activity studiesin some fish species collected from a mercury contaminated estuary[J]. Water， Air， and Soil Pollution 1990， 53（3）：327-334.

[30]JEBALI J， BANNI M， GUERBEJ H， et al. Effects of malathionand cadmium on acetylcholinesterase activity and metalloth-ionein levels in the fish Serioladumerilli[J]. Fish Physiology Bio-chemistry， 2006，32（1）：93-98.

[31]THANGNIPON W， THANGNIPON W， LUANGPAIBOON P， etal. Effects of the organophosphate insecticide， monocrotophos，on acetylcholinesterase activity in the nile tilapia fish （Ore-ochromis niLoticus） brain [J]. Neurochemical Research， 1995， 20（5）：587-591.

[32]MIN S K， KIM J H， KIM S， et al. Various biomarker and bioindicator responses in muddy loach （Misgurnus anguillica-datus） exposed to endosulfan for 21 days[J]. Toxicology Envi-ronmental Health Sciences， 2010， 2（2）：125-131.

[33]REDDY P M， PHILLIP G H. In， vivo inhibition of AChE and ATPase activities in the tissues of freshwater fish， Cyprinus carpio exposed to technical grade cypermethrin[J]. Bulletin of Environmental Contamination Toxicology， 1994，52（4）：619-626.