定量研究石斛醇提取物对酵母朊病毒的治愈作用

刘宴村 李辉 张艳 窦爽 张波 宋有涛

摘要：为研究石斛醇提取物的抗朊病毒作用，借助酵母朊病毒[PSI+]表型系统分析石斛醇提取物对酵母朊病毒[PSI+]表型的作用，引入半变性琼脂糖凝胶电泳技术在蛋白质水平分析石斛醇提取物对酵母朊病毒的治疗效果结果显示，石斛醇提取物浓度在15g/L时，作用酵母朊病毒[PSI+]细胞5d的治愈率为5%；并且石斛醇提取物浓度在5～20g/L范围内时，药物剂量与酵母朊病毒[PSI+]表型治疗效果呈现较好正相关性。蛋白水平试验表明石斛醇提取物作用酵母朊病毒[PSI+]细胞5d后红色菌落的朊病毒聚集体大小与[psi-]相似。

关键词：石斛醇提取物；酵母朊病毒；[PSI+]；治愈

中图分类号：S859.3

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2014）04-0344-05

朊病毒是一类能在人和哺乳动物中引起可传染性海绵状组织脑病（transmissible spongiformencephalopathies，TSEs）的病原体，由于其致病机理的复杂性，迄今为止对于朊病毒疾病仍缺乏有效的治疗药物。我国的中医、中药学对于阿尔茨海默症和帕金森病等与朊病毒疾病发病机理相似的疾病的治疗有悠久的历史，而且有研究显示在绿茶和姜黄提取物中存在具有抗朊病毒活性的成分，暗示着中药在筛选抗朊病毒药物中的巨大潜力。

近年来，抗朊病毒药物筛选模型是国际上筛选抗朊病毒候选药物的热点；由于动物朊病毒细胞模型不具备明显的细胞表型；并且存在着与哺乳类动物内朊病毒交叉传染的危险性，使得实验成本昂贵、操作繁杂，严重限制了该领域的研究进展；而酵母朊病毒[PSI+]具有易于检测的遗传表型及其与动物具有严格种间屏障的优势，因此基于酵母细胞的抗朊病毒候选药物筛选模型在大规模筛选上具有经济、安全和易实现高通量筛选等特性，而越来越受到关注；而且利用酵母模型Bach等从近4000种小分子化合物中筛选发现了11种可以治愈酵母朊病毒细胞的化合物，并且证实KP16-氨基菲啶和胍那苄等3种化合物能够在动物细胞模型中清除聚集状态的哺乳动物朊病毒。本研究借助酵母朊病毒[PSI+]模型并结合表型实验和半变性琼脂糖凝胶电泳技术（semi-denaturing detergent-agarose gel electroph-oresis，SDD-AGE），研究石斛醇提物对酵母朊病毒[PSI+]的治愈作用。

l材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种

酿酒酵母（Saccharomyce.s cerevisiae）： MA Takar1 SUQ5 ade2-1 his3△202leu2△l trp1△63 ura3-52 erg6：：KanMX，[PSI+]。

1.1.2培养基

1/2YPD液体培养基：0.5%酵母浸出粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖，葡萄糖单独灭菌。

1/2YPD固体培养基：0.5%酵母浸出粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂粉，pH天然，葡萄糖单独灭菌。

YPAD固体培养基：1%酵母浸出粉、2%蛋白胨、0.04%腺嘌呤、2%葡萄糖、2%琼脂粉，葡萄糖单独灭菌。

SD-Ade固体培养基：0.7% YNB-AA、2%葡萄糖、2%琼脂粉，pH天然，葡萄糖单独灭菌。倒平板前加入氨基酸His、Ura、Trp、Leu分别为20、20、20、60mg/L。

1.1.3主要试剂和仪器

石斛购于辽宁省沈阳市国大药房；腺嘌呤、尿嘧啶、色氨酸等购于北京市鼎国技术有限公司：羊抗Sup35抗体与HRP标记的驴抗羊IgG购于圣克鲁斯生物技术公司（美国）；琼脂糖水平电泳槽（DYC0-31DN，北京六一公司）；转膜仪（Bio-Rad公司，美国）；珠磨破碎仪（Bio spec公司，美国）；旋转蒸发器（RE52CS-2，上海亚荣生化仪器厂）。

1.2方法

1.2.1石斛醇提取物的制备

称石斛粉末10g，加入8倍体积的80%乙醇回流提取3次，每次3h，合并3次的提取液，60℃减压蒸发，浓缩至50mL，然后烘干至恒重，用5% DMSO（二甲基亚枫）溶解成200g/L的提取液备用。

1.2.2石斛醇提取物对酵母朊病毒[PSI+]治愈作用的研究

[PSI+]酵母细胞在24℃过夜活化培养后，调整菌液光密度OD600为0.2左右，按10%接种量分别接种到含有不同浓度石斛醇提取物的1/2 YPD液体培养基中，所有体系于24℃振荡培养5d，每隔24h更换培养基和石斛醇提取物；分别在1、3、5d取培养液稀释后涂布于1/2 YPD固体平板，平板于24℃恒温培养7d，观察菌落颜色变化，统计阳性菌落的比例[15]。

1.2.3石斛水提取物的制备及对酵母朊病毒[PSI+]作用的研究

称石斛粉末10g，加入100mL蒸馏水回流提取3h，用滤液配制1/2 YPD液体培养基，灭菌后备用。[PSI+]酵母细胞在24℃过夜活化后，到菌液光密度OD600为0.2左右时，按10%接种量接种到含有石斛水提取物的1/2 YPD液体培养基内，并于24℃培养，每天更换培养基；5d后稀释培养液并涂布于1/2 YPD固体平板，平板于24℃培养，观察菌落颜色变化。

1.2.4遗传表型实验分析石斛醇提取物对酵母朊病毒[PSI+]的治疗效果

采用表型分析法分析中药作用酵母朊病毒后的假阳性与假阴性结果；随机挑取石斛醇提取物治愈酵母朊病毒[PSI+]后的红色菌落划线于1/2YPD平板上，分别影印到SD-Ade、1/2 YPD和YPAD固体平板上，24℃培养5d后记录实验结果。

1.2.5半变性琼脂糖凝胶电泳结合蛋白质免疫印迹技术分析石斛醇提取物对酵母朊病毒[PSI+]的治疗效果

挑取石斛醇提取物治愈酵母朊病毒后的红色菌落活化，接种到YPD液体培养基中30℃培养约16h，到菌液OD600=1.5左右时停止培养，离心收集细胞，加入裂解缓冲液，用珠磨仪裂解细胞，离心收集上清得到蛋白样品；然后采用SDD-AGE/Western blot，首先进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后用在0℃、恒流0.35A条件下转膜1h，将蛋白转移到PVDF膜上，羊抗Sup35抗体孵育lh，4℃过夜，HRP标记的驴抗羊IgG孵育lh后，洗膜，采用ECL发光试剂盒对其进行放射自显影检测，获得图像信息。

2结果与分析

2.1石斛醇提取物和水提取物对酵母朊病毒[PSI+]治愈作用的研究

酿酒酵母的ade2-1等位基因在ADEl （或ADE2）营养缺陷型标记编码基因的开放阅读框（ORF）（该基因编码酵母合成腺嘌呤途径所必须的ade 1酶）起始处有一个乳白终止密码子。在[PSI+]细胞中，Sup35p聚集形成淀粉样蛋白，导致无义突变抑制，产生终止密码子通读现象，合成腺嘌呤，使[PSI+]细胞在缺乏腺嘌呤的培养基上生长为白色菌落：在[psi-]细胞中，其Sup35p主要以单体形式存在，非无义抑制的ade2-1突变株需要在含有腺嘌呤的培养基上生长，由于累积腺嘌呤合成途径中的副产物，细胞因而形成红色菌落如图1 （注：因为是黑白印刷，所以在本文的图中根据红色深浅显示为深灰色或黑色），这个颜色指示系统可用来初步分析酵母朊病毒的存在状态。根据实验结果，石斛水提取物作用酵母朊病毒5d后，无红色菌落出现，石斛水提取物不能治愈酵母朊病毒所以研究5、10、15、20g/L石斛醇提取物对酵母朊病毒[PSI+]表型的治疗作用，如图2所示石斛醇提取物浓度为15g/L时，对酵母朊病毒[PSI+]具有明显的治愈效果，治愈率为5%，但是当石斛醇提取物浓度为20g/L时，出现抑菌性。

2.2遗传表型实验分析石斛醇提取物对酵母朊病毒[PSI+]的治疗效果

为了进一步验证15g/L的石斛醇提取物表型上的治愈效果是否是假阳性，随机选取15g/L的石斛醇提取物治愈的酵母朊病毒平板上出现的红色菌落划线于1/2 YPD同体平板上，分别影印到YPAD、SD-Ade和另一个1/2 YPD平板上。由图3可以看出，被石斛醇提取物治愈的酵母细胞在1/2 YPD培养基上为红色，在YPAD为白色菌落，而在缺乏Ade的培养基上不生长（由于黑白印刷，所以在本文中红色为深灰色，白色还是白色）。因此，在表型水平上的结果表明15g/L的石斛醇提取物对酵母朊病毒有一定的治愈效果。

2.3半变性琼脂糖凝胶电泳结合蛋白质免疫印迹技术分析石斛醇提取物对酵母朊病毒[PSI+]的治疗效果

在酵母朊病毒中，ADE1或ADE2的突变都会导致中间产物AIR的聚集，从而导致红色素的聚集。而在这个合成途径的较早步骤如果发生突变的话，例如ADE4、ADL5、ADE8、ADE6或者ADE7，就会在AIR合成之前阻断该途径并且阻止红色素的聚集，从而无论朊病毒的状态如何都会出现白色菌落。因此基于表型判定朊病毒状态的方法虽然直观，并且大部分时候是准确的，仍然不能排除假阳性实验结果的出现。所以，需进一步在蛋白水平上研究石斛醇提取物对酵母朊病毒的治愈效果。

聚集体的相对分子质量大小是反应酵母朊病毒聚集程度的重要指标，而SDS-PAGE/Westernblot技术仅能分析朊病毒是否发生聚集，近年来发展的半变性琼脂糖凝胶电泳（SDD-AGE）结合Western blot技术能够精确检测朊病毒聚集体大小。所以本研究采用SDD-AGE/Western blot比较了不同表型菌落Sup35p蛋白的聚集状态。本实验随机分析了石斛醇提取物15g/L作用5d后出现的红色菌落朊蛋白聚集体大小。如图4所示对照的[PSI+]细胞朊病毒Sup35p蛋白主要以聚集体形式存在，而在[psi-]细胞中，Sup35p主要以单体形式存在。石斛醇提取物15g/L培养条件下治愈酵母朊病毒后其红色菌落为可溶的单体形式，说明石斛醇提取物作用后的红色菌落已被治愈。

3讨论

借助本实验室构建独有的抗酵母朊病毒药物筛物筛选平台，采用酵母朊病毒[PSI+]表型和半变性琼脂糖凝胶电泳结合免疫印迹技术分析了石斛醇提取物抗朊病毒作用；研究结果表明，石斛水提取物不能治愈酵母朊病毒[PSI+]，而石斛醇提取物对酵母朊病毒[PSI+]具有明显的治疗效果，表明石斛中含有能够治疗酵母朊病毒的成分，而且它存在于醇提取物中。石斛属是兰科中最大的一个属，是一种传统中草药具有驱解虚热、益精强阴的作用，现代药理研究表明石斛还有抗衰老、提高免疫力和抗肿瘤等作用。石斛中的有效成分为生物碱类、酚类、多糖类、苯类极其衍生物等。有文献表明石杉中的生物碱石杉碱甲是一种可逆的胆碱酯酶抑制剂，对乙酰胆碱酯酶有较强的抑制作用，是一种可用于治疗阿尔茨海默病的药物，石斛中同样含有生物碱，所以推测石斛中的生物碱类有治疗酵母朊病毒的作用，但是这需要后续实验证实。近几年来无论从中药有效成分的提取到天然药物的开发都得到了很大的进展，中药以其毒副作用小，疗效确切占据独特优势，相继发现了何首乌、人参皂苷、积雪草酸、银杏、两面针等极具前景的抗阿尔茨海默病活性成分。本文研究显示了传统中药石斛的醇提物具有良好的治疗酵母朊病毒活性，表明在中药领域存在具有抗朊病毒活性的物质，对于研究和开发抗哺乳动物朊病毒的中药制剂具有重要的意义，同时也有利于国际社会对中药的认同，加快中药的国际化。