3种桑蟥基因组DNA提取方法比较研究

王钰婷 汪泰初 李瑞雪 王伟

摘  要：为了探寻一种高效、稳定、廉价的桑蟥基因组DNA提取方法，通过采用CTAB法、蛋白酶K法和盐析法3种方法研究桑蟥基因组DNA的提取。对提取的DNA进行分光光度值的测定以及COI基因的扩增鉴定。结果表明：3种方法均可以提取基因组DNA，蛋白酶K法和CTAB法DNA获得率优于饱和NaCl法提取的DNA，3种方法提取的DNA都可用于PCR扩增实验。因此，在实际工作中可根据实验目的、条件选取最适合的方法。

关键词：桑蟥;DNA提取;CTAB法;蛋白酶K法;盐析法

中图分类号：S-186    文献标志码：A    论文编号：2014-0684

Comparison of Three Methods for Genomic DNA Extraction from the Rondotia menciana Moore

Wang Yuting， Wang Taichu， Li Ruixue， Wang Wei

（The Sericultural Research Institute， Anhui Academy of Agricultural Science， Hefei 230061， Anhui， China）

Abstract： To explore an efficient， stable， low-cost DNA extraction method from Rondotia menciana Moore， genomic DNA was extracted using CTAB， protein enzyme K and salting-out method， respectively. The extracted genomic DNA samples of three methods were tested using photometric analysis and COI gene amplification. The results showed that， all the three methods can be used for the total DNA extraction， which are suitable for the PCR amplification， but genome DNA extracted by CTAB method and protein enzyme K method were higher in purity and production， degraded slightly. So we should select the proper method according to the objective and condition in the study.

Key words： Rondotia menciana Moore; DNA Extraction; CTAB Method; Protein Enzyme K Method; Salting-out Method

0  引言

桑蟥（Rondotia menciana Moore）是桑树芽叶的重要害虫之一。鳞翅目、蚕蛾科，别名桑蚕、白蚕、白蟥、松花蚕等。桑蟥分布于安徽、江苏、浙江、山东、河南、河北、山西、陕西、甘肃、湖南、湖北、江西、四川、广东及东北各省。寄主主要为桑树，被侵害的桑树满叶虫孔，蟥茧累累，叶黄如麻，严重影响秋蚕生产，是重要的国际性检疫害虫。

随着分子生物学技术的飞速发展，从DNA水平对昆虫进行物种分类鉴定、遗传多样性分析、探讨系统发育、进一步研究物种起源与进化已成为现代昆虫分子系统学和系统发育学的研究热点[1]。而获得高质量的基因组DNA是分子生物学实验的基本需要，是进行分子标记、基因克隆及基因表达研究等下游技术的必要前提。因此寻求简便、快速、有效的DNA提取方法，对于进一步开展分子生物学研究具有十分重要的意义[2]。

刘波等[3]用CTAB法成功提取了稻蝗昆虫的干标本和酒精浸泡标本DNA。荣万韬等[4]用蛋白酶K法对单条线虫的基因组进行提取，探寻到一种高效稳定的DNA提取方法。张拓等[5]用比较了4种大豆蚜基因组DNA提取方法，结果证明盐析法能够更快速有效的提取大豆蚜基因组DNA。目前，对于昆虫基因组DNA提取研究较少，仅限于双翅目、直翅目中的一些昆虫[6]，关于鳞翅目昆虫基因组DNA提取的研究国内外鲜有报道。笔者采用3种昆虫基因组DNA提取的常用方法，即CTAB法、蛋白酶K法和盐析法稍作改进，以桑蟥为研究材料，通过基因组DNA OD260/280值、琼脂糖凝胶电泳检测，比较了3种方法提取的基因组DNA的质量，旨在为进一步深入开展其亲缘关系分析、基因组比较、遗传多态性和某些特定基因的标记等分子生物学研究提供一定的基础资料。

1  材料與方法

选用3种不同方法从桑蟥幼虫中提取基因组DNA，并经琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增产物电泳来检测提取的DNA的纯度和浓度。

1.1  材料

桑蟥，2013—2014年间采集于安徽省农业科学院蚕桑研究所的桑园内，经专家鉴定后用95%乙醇浸泡，放置于-20℃冰箱中保存。

1.2  桑蟥基因组DNA抽提方法

1.2.1  CTAB法  参照刘佳妮等[7]的方法，稍加改进。

（1）将单头桑蟥幼虫置于1.5 mL离心管中，加入400 ?L 2% CTAB提取缓冲液（0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0），0.02 mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2% CTAB），    -20℃放置10 min。充分研磨， 匀浆;（2）65℃水浴2 h，其间轻轻混匀2次，4℃ 10000 r/min离心15 min;（3）取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）抽提，混匀，10000 r/min离心10 min，取上清，反复抽提2次;（4）75%乙醇漂洗沉淀2次，无水乙醇漂洗，室温干燥，使乙醇挥发干净。（5）加入30 μL灭菌ddH2O，充分溶解后于-20℃保存备用。

1.2.2  蛋白酶K法  参照其他的昆虫提取方法[8-9]加以优化改进。

（l）取单头昆虫放在1.5 mL离心管中，加入100 ?L DNA裂解液（100 mmol Tris-HCL （pH 8.0），25 mmol EDTA （pH 8.0），500 mmol NaCL，1% SDS）。研磨，用400 ?L裂解液冲洗研磨棒。（2）加入蛋白酶K至终浓度100 ?L/mL，45℃水浴1 h，加入RNase A至终浓度20 ?L/mL，水浴15 min。（3）等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）、氯仿：异戊醇（24：1）分别抽提一次，14000 r/min离心10 min。（4）取上清，加入2.5倍体积无水乙醇，14000 r/min离心10 min。（5）75%乙醇漂洗沉淀2次，无水乙醇漂洗，室温干燥，使乙醇挥发干净。（6）加入30 μL灭菌ddH2O，充分溶解后于-20℃保存备用。

1.2.3  盐析法  参照Sunnucks等[10]的方法，稍加改进。

（1）将单头桑蟥幼虫置于1.5 mL离心管中，加入20 μL DNA提取缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，400 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，1% SDS）研磨。（2）加入200 μL DNA提取缓冲液和6 μL蛋白酶K（20 mg/mL），充分混匀，置于60℃水浴1 h，中间取出混匀  2次。（3）加入80 μL 5 mol/L NaCl，充分振荡15 s，4℃ 10000 r/min离心15 min，沉淀蛋白质，取上清液于另一离心管中。（4）加入2倍体积的冰冻无水乙醇，上下颠倒5次，至溶液彻底混匀，-20℃放置1 h。（5）4℃ 14000 r/min离心10 min，弃上清液。（6）加入300 μL预冷的75%乙醇，4℃ 10000 r/min离心15 min;将管口向下让DNA自然干燥。（7）加入30 μL灭菌ddH2O，充分溶解后于-20℃保存备用。

1.3  浓度和纯度的检测

1.3.1  琼脂糖凝胶电泳  采用稳压稳流电泳仪（DYY-Ⅲ2型）和STS型紫外透射分析仪。其中琼脂糖的浓度为1.0%，电压为100 V，电泳时间为40 min。

1.3.2  紫外分光光度计检测  采用日本分光株式Jasco公司（V-560型）的紫外分光光度计分别测定這3种方法提取的基因组DNA在260、280 nm处的吸收值，并根据OD260/280计算其纯度。产量计算公式为[dsDNA]=50×OD260×稀释的倍数。

1.3.3  PCR  扩增比较不同的模板DNA  PCR扩增引物采用Chris Simon等[11]发表的昆虫蛋白质编码细胞色素C氧化酶亚基I（COI）基因通用引物，上游引物C1-J-1718：5'-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3'和下游引物C1-N-2191：5'-CCCGGTAAAATTAAAATAT AAACTTC-3'。引物由宝生物（大连）工程有限公司合成。PCR扩增反应在Thermo Hybaid PCR仪上进行。PCR的反应体系为50 μL。内含10×反应缓冲液，    2.5 mmol/L dNTP，25 mmol/L Mg2+，上下游引物各为20 pmol/μL，5 U/μL Taq酶，DNA模板50 ng，扩增条件为：95℃预变性5 min;循环周期依次为94℃变性40 s，47℃退火40 s，72℃延伸1 min;35个反应循环，72℃延伸10 min。为验证PCR的可重复性和一致性，用同样的反应体系和程序重复3次，至结果稳定。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

2  结果与分析

2.1  琼脂糖凝胶电泳检测

分别将3种方法提取的DNA在1%琼脂糖上电泳，结果如图1所示。3种方法都能成功提取到桑蟥基因组DNA（图1）。

2.2  PCR扩增效果检测

将3种方法所提DNA进行PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳，效果如图2所示。3种方法抽提的DNA都能得到高效扩增，扩增效果无明显差异。

2.3  3种提取方法比较

DNA纯度的判断根据OD260/280的比值判断，符合要求纯度高的DNA其OD260/280≈1.8。若OD260/280<1.6，说明样品中存在蛋白质，应再用氯仿/异戊醇抽提，以乙醇沉淀纯化DNA;若OD260/280>1.9，说明DNA中含有RNA，可考虑用RNA酶处理样品[12]。本实验中蛋白酶K法和CTAB法电泳检测点样孔干净，主带清晰整齐，无拖尾现象，DNA获得率都在50 ng/μL以上，PCR扩增效果较好。提取的DNA样品在OD260/280的吸光值均在1.6～1.9之间，说明得到的DNA比较纯净，蛋白质、多糖及酚类杂质去除的比较完全;饱和NaCl法提取的DNA电泳后条带不太规整，有明显的降解，说明提取的DNA不太纯净，样品OD260/280都小于1.6，说明提取的DNA可能夹杂着蛋白质、多糖等杂质，纯度不高。

3  结论与讨论

DNA提取是分子生物学实验的基础，制备完整的、纯度高的核酸是进一步试验的关键因素。所以，总DNA的提取作为起始步骤是分子生物学技术的基础和前提。但是昆虫种类繁多、形态结构千差万别，不同生物的基因组DNA需要采取不同的提取方法，但主要的步骤都包括破膜释放DNA、抑制核酸酶和除去蛋白质与其他大分子等。在核酸提取的过程中仍存在着很多困难，如DNA含量相对较少，分离难度大，易被降解等。由于昆虫个体较小，其核酸含量就更少，提取工作更加困难，因此，选取适合的DNA提取方法至关重要[13-14]。

本实验比较分析了3种桑蟥基因组DNA提取方法，利用CTAB法提取桑蟥DNA，整个实验过程耗时短，不需要昂贵的仪器设备和实验药品，易于在一般的实验室里完成整个操作。而蛋白酶K法相对于CTAB法，所需试剂价格较昂贵，成本较高。在实验时间充裕的情况下，可以从这2种方法中选择;盐析法操作简单连贯，不使用苯酚、氯仿、异戊醇等有毒试剂，但是降解较严重，产率较低，纯度较差，3种方法提取的DNA均可用于PCR扩增。因此可以根据不同的实验条件选择使用。

根据已发表的相关文献，已有很多提取昆虫DNA的方法，但是至今未发现一种通用的方法[15]，不同生物DNA的提取方法不尽相同，但各种提取方法也有很多相通之处，可以相互借鉴。当然随着分子生物学的快速发展，各种简洁、高效的DNA提取方法也会不断的创新出现，相信这些方法在不断的优化后可以更好地应用于鳞翅目昆虫的基因提取实验[16]。

参考文献

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[3] 刘波，郑哲民，张迎春，等.稻蝗属基因组 DNA提取方法[J].陕西师范大学学报，自然科学版，1999，27（3）：97-99.

[4] 荣万韬，王金成，刘鹏，等.单条线虫DNA提取方法研究[J].华北农学报，2014，29（2）：127-132.

[5] 张拓，庞春杰，韩岚岚，等.大豆蚜基因组DNA四种提取方法的比较[J].大豆科学，2013，32（4）：473-476.

[6] 魏方超，杨茂发，彭瑶，等.稻水象甲AFLP分析中基因组DNA提取方法的研究，2012，40（9）：129-132.

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[8] 田英芳，黄刚，郑哲民，等.一种简易的昆蟲基因组DNA提取方法[J].陕西师范大学学报：自然科学版，1999，27（4）：82-84.

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