山东灰霉病菌对腐霉利的抗药性检测

刘超 张悦丽 张博 李长松 石磊 齐军山

摘  要：为监测灰霉病菌对腐霉利的抗药性，2012年12月到2013年5月，在山东省内10个市县，采集灰霉病菌样本150余份，分离得到灰葡萄孢（Botrytis cinerea）菌株130株，采用生长速率法对130株灰霉病菌进行抗药性检测。结果表明，腐霉利对灰霉病菌的EC50的范围为0.1208～12.486 ?g/mL，平均EC50为4.03 ?g/mL，抗性频率达到67.69%。其中低抗菌株占52.38%，中抗菌株占19.048%，未检测到高抗菌株。本研究可为灰霉病的防治特别是杀菌剂的轮换使用提供依据。

关键词：灰葡萄孢;杀菌剂;腐霉利;抗药性

中图分类号：S482.2    文献标志码：A    论文编号：2014-0213

Resistance Detection for Botrytis cinerea Against Procymidone in Shandong Province

Liu Chao1，2， Zhang Yueli2， Zhang Bo2， Li Changsong2， Shi Lei1， Qi Junshan2

（1School of Life Science， Qufu Normal University， Qufu 273165， Shandong， China;

2Institute of Plant Protection， Shandong Academy of Agricultural Sciences/

Shandong Province Key Laboratory of Plant Virology， Jinan 250100， Shandong， China）

Abstract： In order to monitor procymidone resistance of Botrytis cinerea， from December of 2012 to May of 2013， many Botrytis cinerea samples were collected from 10 cities in Shandong， and 130 isolates were purified from them. The resistances of Botrytis cinerea were determined in 130 isolates by measuring the mycelia growth on the fungicide-amended media. The means of the 50% effective concentration values （EC50） were 4.03 ?g/mL. The resistance frequency was 67.69%， 52.38% of Botrytis cinerea was low resistant strains， 19.048% of Botrytis cinerea was moderate resistant strains; there was no high resistant strain. The results provided a theoretical basis for using fungicides efficiently to prevent and control botrytis cinerea in the field.

Key words： Botrytis cinerea; Fungicides; Procymidone; Resistance

0  引言

灰霉病是危害最严重、分布最广泛的植物病害之一，其病原灰葡萄孢（Botrytis cinerea），于2012年被《Molecular Plant Pathology》杂志评为最重要的十大植物病原真菌中的第2位。可侵染番茄、草莓、梨、黄瓜、西葫芦、芸豆、莴苣、辣椒、猕猴桃、葡萄以及核桃甚至小麦等数百种作物[1-5]。据黑龙江农科院的王春艳[6]报道，1988年黑龙江省绥化地区大面积爆发灰霉病，损失高达38%～42%，发病面积占生产面积的80%以上，造成了严重的经济损失。

灰霉病菌繁殖快、易变异，其防治难点在于极易产生抗药性。国内外对灰霉病抗药性有不少的报道，1992年刘波等[7]发现某些地区的灰霉菌株对腐霉利有一定的抗药性，并得出苯并咪唑类和二甲酰亚胺类的抗药性二者不存在交互抗性的结论。1997年，李林等[8]在对282株灰霉菌株的研究中，发现多菌灵的抗性菌株已经达到了81.9%，而对腐霉利已经产生抗性，大多数菌株处于低抗水平。2001年，丁中等[9]在山东3个保护地的采样结果表明，多菌灵与腐霉利的双抗菌株的频率达到100%。病菌的抗药性监测是一项日常性又极为重要的工作，虽然已经有不少类似的研究，但是不同地区的病菌抗药性不同。即便同一地区，随着时间的发展，病菌的抗药性也会发生变化。本研究的目的是对当前山东地区灰霉病菌對腐霉利抗药性进行检测，为田间用药以及灰霉病的防治提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  灰霉菌株的采集与分离

2012年12月—2013年5月，在山东省内10个城市的多个区县保护地，以大棚为单位进行灰霉病果和病叶的采集，每个大棚采集2～4个病果或者病叶。将样品包好带回实验室，分离纯化，获得灰霉菌株。

1.2  供试药剂

98.4%腐霉利原药（如东县华盛化工有限公司）。

1.3  供试含药培养基

98.4%腐霉利原药用丙酮配制成10000 μg/mL的母液，且以0.2%的量加入乳化剂Tween-80。将母液置于4℃冰箱内贮存，将其稀释到合适的浓度使用。

1.4  抗药频率的测定

本实验采用最低抑制法（MIC），以Yarden[10]标准为基准，如果能在5 μg/mL腐霉利PDA含药平板上生长的菌株为抗性菌株。

将待测菌株在21℃的恒温培养箱中培养3天，用5 mm的打孔器在菌落的边缘打孔，将菌柄移至带药平板中央，培养5天，观察结果，统计菌株的抗性频率。

1.5  抗性水平的测定

采用生长速率法，将抗性和敏感菌株分别在含有腐霉利梯度平板上进行毒力测定，重复3次，待4～5天，对照长满平板时，采用十字交叉法量取菌落直径，计算抑制率。利用DPS统计软件，计算菌株的EC50，得到菌株的抗性水平。

抗性菌株=[抗性菌株EC50敏感菌株EC50]

根据抗性水平，可将灰霉菌株分为3种抗性类型[11]，如果抗性菌株的EC50与敏感菌株的EC50的比值小于10时，则为低抗型，如果在11～100倍之间时，则为中抗型，如果大于100倍时，则为高抗型。

2  结果与分析

2.1  灰霉病原菌的分离和基本特征

将采集到的灰霉病样品，室内分离并得到Botrytis cinerea菌株130株，经观察发现，灰葡萄孢菌落初为白色，产孢后菌丝聚集呈褐色;分生孢子梗数根丛生，具隔，褐色，顶端具有分枝，梗顶稍膨大，呈棒头状，其上密生小柄并有大量分生孢子。灰葡萄孢菌在平板上的形态如图1。

2.2  灰霉病菌对腐霉利抗性频率测定

以5 μg/mL为抗感标准，灰霉菌株对腐霉利敏感菌株42株，抗性菌株88株，抗性频率为67.69%。通过对不同地区的抗性频率的统计（如图2）发现，枣庄地区对5 μg/mL腐霉利的抗性频率达到93.33%，而聊城地区的抗性频率为0%，由此可见，各地区对腐霉利的抗性频率是不尽相同的。

2.3  灰霉菌株对腐霉利抗性水平测定

在分离得到的130株中，根据地区分布选取21株进行抗药性测定，EC50的范围为0.1208～12.486 ?g/mL，平均EC50为4.03 ?g/mL，根据抗性频数分布图（图3）可以得知，大部分的EC50分布在1～5 ?g/mL，其中敏感菌株为28.571%，低抗菌株为52.38%，中抗菌株为19.048%，没有高抗菌株。

3  结论与讨论

二甲酰亚胺类杀菌剂腐霉利，在20世纪70年代曾被认为是苯并咪唑类药物的最佳替代品。早在1971年Bollen和Scholten[12]就已经发现了苯并咪唑类的抗药性菌株，而二甲酰亚胺抗药性菌株的发现大多集中在八九十年代。1992年Moorman和Lease[13]调查了13个宾夕法尼亚州的种植园，发现苯并咪唑类和二甲酰亚胺类的抗药性菌株，并且发现双抗菌株，1996～1997年，Yourman和Jeffers[14]从35个保护地325株灰霉菌株中，发现69%的菌株对二甲酰亚胺类农药乙烯菌核利有抗药性，而对苯并咪唑类和二甲酰亚胺类的双重抗药性菌株达67%。根据1997年英国人LaMondia和Douglas[15]报道，45株灰霉菌中有43%对二甲酰亚胺类农药乙烯菌核利存在抗药性。这说明，自20世纪90年代以来，二甲酰亚胺类杀菌剂的抗药性问题越来越突出。

本实验室自20世纪90年代开始监测灰霉病菌的抗药性，1997年曾对腐霉利的抗药性进行过报道[8]，结果发现EC50值在1.1598～4.5631之间，全部为低水平抗性菌株，未检测到高水平抗性菌株。本次检测结果EC50有66.67%分布在1～6 ?g/mL之间，其中低抗菌株为52.38%、中抗菌株为19.048%，没有高抗菌株。与十几年前的检测结果相比，经过10余年的用药，其EC50的范围波动不大，但是抗性频率、抗性水平明显提高。结果中聊城地区灰霉菌株抗药性频率为0%，可能与采样范围及其代表性有关。抗药性的产生，主要是因为种植者在一个生长季节内持續使用同一种杀菌剂，使病菌面临强大的选择压力产生抗性菌株。近年来由于乙霉威、嘧霉胺、嘧菌环胺等不同类型杀菌剂的交替使用，延缓了腐霉利抗药性的大面积发生。生产上，应该综合应用农业措施、生态治理、生物防治以及轮换使用不同类型的化学杀菌剂来防治灰霉病，避免连续使用单一的化学杀菌剂以免病菌产生抗药性导致防治失败。

参考文献

[1] Jarvis W R. Botryotinia and Botrytis species： taxonomy， physiology and pathogenicity： a guide to the literature[M]. Canada： Canada Department of agriculture，1977：1-20.

[2] 齐军山，张悦丽，张博，等.设施番茄灰霉病绿色防控技术[J].中国蔬菜，2013（15）：26-27.

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[13] Gary W Moorman， Roxanne J. Lease， Benzimidazole and dicarboximide resistant Botrytis cinerea from Pennsylvania greenhouses [J]. Plant Disease，1992，76（5）：477-480.

[14] Yourman L F， Jeffers S N. Resistance to benzimidazole and dicarboximide fungicides in greenhouse isolate of Botrytis cinerea[J]. Plant Disease，1999，83（6）：569-575.

[15] Lamondia J A， Douglas S M. Sensitivity of Botrytis cinerea from onnecticut green houses to benzimidazole and dicarboximide Fungicides [J]. Plant Disease，1997，81（7）：729-732.