体细胞突变在系统性红斑狼疮的自身抗体产生中的作用

石彬　姚新生

【摘 要】系统性红斑狼疮是最经典的慢性自身免疫性疾病，该病患者血清中存在多种自身抗核抗体。然而这些自身抗体的产生机制十分复杂，涉及多方面因素。体细胞突变便是诸多因素中的一个，由于目前国内有关体细胞突变与自身抗体关系的综述甚少，本文借此机会就这方面的研究状况作一概述，旨在更好地理清体细胞突变与SLE自身抗體产生的关系。

【关键词】系统性红斑狼疮；体细胞突变；高频突变；抗dsDNA；生发中心

【中图分类号】R593. 241 【文献标识码】B 【文章编号】1004-7484（2014）02-0872-02

1 引言

系统性红斑狼疮（SLE）是一种病因未知的全身性自身免疫性疾病。在SLE患者血清中存在多种自身抗体，能结合dsDNA、RNA、染色体、RNA结合蛋白和磷脂。其中，具有诊断价值的自身抗体包括抗dsDNA、抗SM和抗心磷脂抗体。抗dsDNA是在SLE中研究得最多自身抗体，其产生与人类SLE疾病和小鼠自身性狼疮样肾炎相关。抗dsDNA常被发现于肾脏沉积，并且可以从肾脏洗脱。早期研究已证明，小鼠和人类单克隆抗dsDNA均可以通过过继转移到正常小鼠引起蛋白尿。然而，抗dsDNA在肾小球沉积的机制仍不清楚。

2 体细胞突变发生于抗dsDNA 的VH和VL区

第一个在分子细节上分析的抗DNA的抗体是IgM型抗DNA，是从健康的人和鼠中分离得到的。IgM型抗DNA属于天然抗体库，具有多反应性。这些IgM型抗体是由V区缺乏体细胞突变的免疫球蛋白可变区基因的重链（VH）和轻链（VL）编码而产生的。早期不成熟的B细胞库里有高达50%的不成熟B细胞表达针对自身核抗原的多反应性受体。绝大多数的多反应性和自身反应性克隆会在B细胞发育的两个不同耐受检查站被清除。尽管如此，在初始细胞库里仍有约6%的子集存在多反应性。另人意外的是，来自健康人受试者的IgG记忆B细胞也显示了很高的多反应性[1]。目前，仍不清楚的是，这群多反应性的B细胞能否代表高亲和力的抗dsDNA B细胞的前体。

与这些天然抗体的VH和VL序列分子分析相比，来源于鼠狼疮模型和SLE患者的抗dsDNA的系统性分析揭示了所有这些抗体都出现了体细胞高频突变的迹象。研究表明，在MRL/lpr小鼠中，可能先形成RF B细胞，不久后转变成抗dsDNA B细胞[2]。在所有已分析的杂交瘤中，一个人SLE来源的杂交瘤抗dsDNA的限制性选择实验证明了VH和VL区存在体细胞突变现象[3]。

3 抗dsDNA的体细胞突变模式

抗dsDNA的体细胞突变模式在过去已被深入地分析。一般认为，在狼疮鼠和SLE患者抗dsDNA的V区的互补决定区（CDR）上观察到高频率的置换突变提示抗原驱动了抗dsDNA的选择过程。在抗dsDNA的B细胞中，高频率的体细胞的置换突变将导致产生更多的精氨酸（R）、赖氨酸（K）和天冬酰胺（N），这些氨基酸非常有利于调节带负电的磷酸二酯键和dsDNA的碱基配对的相互作用。另外，在抗dsDNA重链的框架3区（FR3）位点76处会频繁出现体细胞突变来源的R残基，提示该结构域在dsDNA结合方面起着显著作用。R残基出现于抗dsDNA也可由VH-D-JH和 VL-JL重排时CDR3区的连接多样性而产生。此外，非常规的机制也可以参与这个过程，包括阅读框3中D基因的使用、D基因倒置以及D-D融合。

R残基对于dsDNA结合的重要性已用VH3H9链进行了系统的分析，该链是MRL /lpr小鼠来源的抗dsDNA H链的一个原型。在H-CDR2区一个R残基的反转几乎会消除其对dsDNA的结合，然而在这些区域出现由体细胞突变转换的精氨酸时能显著增加其对dsDNA的亲和力[4]。加之，几个R残基的引入也能增加抗dsDNA对dsDNA的亲和力，这表明R残基对抗dsDNA起着增强剂的作用。同时，体细胞突变转变的R残基亦能影响人源单克隆抗体对组蛋白、SmD和RO等自身抗原的结合。

4 自身反应B细胞的高频突变发生于GC内

抗dsDNA和多数其他抗核自身抗体非常类似于由针对病毒或半抗原的T细胞依赖性再次免疫应答所产生的抗体。由于体细胞突变和T细胞依赖的免疫反应中的抗原选择都发生于生发中心（GC），这让人很容易推测，在SLE和鼠狼疮中的抗dsDNA也来源于GC反应中。然而，研究却意外发现，在MRL/lpr小鼠的T细胞区-红髓交界的滤泡外围特定位置，自身反应性B细胞可以进行活跃的高频突变[5]。最近，有一项自身免疫的FcgRIIB缺陷小鼠GC B细胞的深入分析显示，表达GC标志物的体细胞突变来源的B细胞显著地富集于抗核自身抗体[6]。这些结果支持另一个观点，即自身反应B细胞的高频突变发生于GC内。然而，实际表达GC标志物的B细胞却位于GC外。当前，这些滤泡外围特定位置在体细胞突变和抗原选择的抗dsDNA B细胞的进化中的作用仍不清楚。

5 抗核自身抗体来源于体细胞突变后的非自身反应B细胞

为了研究体细胞突变对于抗dsDNA进化的意义，有学者做了3种来源于高活动性SLE患者的抗dsDNA杂交瘤的分析[7]。分析清楚地表明，对dsDNA和核小体高亲力需要一个逐步方式的置换突变才能实现[7]。IgG抗dsDNA杂交瘤的体细胞突变对于dsDNA结合的亲和力是必要的。而对于高亲合力的获得，R、N和L残基通常是最重要的，但在少数情况下，H-CDR1区的谷氨酸残基却变成了必要条件，这说明SLE自身抗体与dsDNA结合的结构上的先决条件是极其复杂的。更重要的是，3种抗dsDNA的在回复突变为胚系基因后，将导致之前检测到结合的任何dsDNA或ssDNA都不能被再次检测[7]。这些结果被一项关于儿童SLE患者的抗ENA自身抗体的分析研究进一步验证[8]。抗ENA B细胞的胚系形式几乎完全失去了对ENA的结合能力。抗桥粒芯糖蛋白在寻常型天疱疮患者遵循同样的原则，即回复突变处理的自身抗体会丧失对自身抗原的反应性。然而，这些分析不能排除H-CDR3区体细胞高频突变的作用，它是由末端脱氧核苷酸转移酶（TDT）引入非模板核苷酸时而产生的。而且，研究显示，TDT缺陷自身免疫小鼠的抗核抗体几乎完全来源于通过体细胞高频突变而获得自身反应性的非自身反应B细胞[9]。

總之，这些研究足以证明一个结论：抗核自身抗体来源于发生体细胞突变的非自身反应B细胞。这一发现对于SLE中B细胞耐受机制的理解具有重要意义。因为非自身反应B细胞前体最不可能被中央耐受机制所影响，所以一直被视作正常B细胞库的一部分。

6 GC反应中高频突变可以创造出抗dsDNA

AGC和AGT是丝氨酸的密码子，在人和鼠抗体的VH和VL基因片段高频出现。然而，在CDR1和CDR2 区的VH和VL基因片段，AGC和AGT的频率分别高于随机密码子取用频率4倍和8倍[9]。CDR1和CDR2 区高频率的AGC和AGT可能是在进化中代替突变热点基序RGYW中的3个而保留下来的。RGYW热点基序是在1992年首次被Rogozin 和 Kolchanow发现的，之后被证明是活化诱导胞嘧啶脱氨酶（AID）的靶标。显然，高频突变集中于热点基序的方式对于保证GC反应中抗体亲和力的成熟是非常有利的。

然而，当AGC/AGT密码子每8个置换突变中出现4个突变为精氨酸和天冬酰胺时，高频突变就会使得抗体存在dsDNA结合的风险[9]。有报道称，来源于非自身免疫个体的IgG 记忆B细胞在经过高频突变后具有较高频率的自身反应性[1]。在小鼠模型尤其是MRL/lpr小鼠，AID在自身抗体和狼疮肾炎的发生发展中具有重要作用。AID缺陷的MRL/lpr小鼠具有明显高的生存率[10]，甚至AID杂合MRL/lpr小鼠都显示了高亲和力致病性抗体产生的延缓[11]。此外，上调MRL/lpr小鼠GC中的AID的表达，将出现突变频率的显著增加，导致广泛的核苷酸插入和删除。这种突变的显著性改变可能会进一步增加GC中抗dsDNA的产生。总之，这些研究说明，在GC反应中高频突变可以创造出抗dsDNA。

7 总结与展望

实际上，SLE中的自身抗体的形成是一个相当复杂的过程，是遗传易感性和细菌或病毒感染等多因素共同作用下的结果。如前文所论述的，自身抗体，尤其是抗dsDNA很可能是GC反应中的副产物。在自身免疫病中，自身反应性抗体的特异性的形成是否是一个持续性过程是一个值得关注的问题，这将对于干预性治疗的研发具有重要的指导作用。如果这是一个持续性过程，未来可以考虑研究靶向GC反应的新型治疗制剂。而最近有研究指出，仅少数或单一的事件或可以诱导SLE自身反应克隆的产生[12]，如果这个假设成立，自身反应中的记忆细胞和浆细胞应当作为更好的治疗靶标。随着这些存在争论的问题的解决和SLE发病机制研究的不断深入，更多更好的治疗策略将会造福人类社会。

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