褐煤精华液对无盐及盐胁迫下小麦萌发的影响

马领弟 秦 谊 朱 辉 张惠芬 何 静 李 顺 李宝才

摘 要：初步研究了褐煤精华液（brown coal distillate，BCD）溶液的组成成分及其对小麦种子萌发的影响。用不同浓度的BCD处理小麦种子烟农19和鲁原301，在无盐胁迫和125 mmol/L NaCl胁迫条件下培养小麦3 d后测定种子发芽率、胚芽鞘的相对伸长速率、质量、渗透调节能力、丙二醛含量及胚根质量。结果显示，BCD能促进小麦种子的发芽，增加胚芽鞘和胚根的质量，提高发芽种子在盐胁迫下的渗透调节能力，降低胚芽鞘中膜脂过氧化产物的增加量。由此推断，BCD可以缓解盐对小麦萌发阶段的伤害，促进小麦种子的萌发

关键词：褐煤：褐煤精华液；黄腐酸；小麦；盐胁迫

中图分类号：S5 12.1

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2014）05-0423-08

一般认为，黄腐酸（fulvic acid，FA）是腐植酸类物质中相对分子质量最小、溶解度最高、生物活性电最强的部分，其含活性官能团多，易被生物体吸收利用。大量研究表明，黄腐酸具有抗盐、抗旱、调节植物生长等诸多植物生理活性。本课题组长期从事黄腐酸化学组成和生物活性的研究，在通过H202氧化降解褐煤的方法制取黄腐酸过程中得到一种无色透明的蒸馏液，该溶液pH值为2～3，密度为1.02～1.05 g/cm3，其中最大相对分子质量小于500（液质联用测定）。初步活性筛选发现，该溶液具有比黄腐酸更强的缓解盐胁迫对小麦种子伤害的活性，同时在无盐胁迫下也具有明显的提高种子发芽率和促进胚芽胚根生长的作用。我们将这种无色透明的溶液命名为褐煤精华液（brown coal distillate.BCD）。

本研究通过测定BCD处理过的两种小麦烟农19和鲁原301的发芽率、胚芽鞘的相对伸长速率和胚芽鞘胚根的长度、鲜重。干重以及胚芽鞘中脯氨酸、可溶性糖、K+、Na+、丙二醛（malondialde-hyde， MDA）含量等指标，系统地考察了BCD埘无盐及盐胁迫下小麦种子萌发的影响。通过BCD对小麦抗盐胁迫活性的研究，以期发现一类新的抗盐活性物质，为小麦抗盐胁迫研究提供理论基础，也为植物抗盐碱高级肥料的开发及盐碱耕地的合理、有效利用提供技术支持。

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材料与方法

1.1 材料

褐煤采白云南峨山县小棚租煤矿.干燥后粉碎，过80目筛，进行理化性质分析。供试种子为小麦种“烟农19”和“鲁原301”。改良的Hoagland's培养液：参照文献[9]配制。

1.2

BCD的制备

将l kg褐煤置于反应容器中，加入浓度为15%的H2O2溶液2 L，连续搅拌3h，温度控制在35 ℃。待氧化反应完成后.将产物离心10 min （转速4 000 r/min），过滤后的上清液即为黄腐酸溶液。将黄腐酸溶液置于旋转蒸发仪中，在50 ℃下抽真空旋蒸。旋蒸完成后得到的同体物质为黄腐酸粗晶。冷凝下来的无色透明的蒸馏液即为褐煤精华液，经测定pH值为2.5，密度为1.04 g/cm3。用蒸馏水将BCD分别稀释为原浓度的（1、5、10、15、20、30、40、50）‰备用。

1.3 BCD的气质联用分析条件

仪器型号：Clarus600气质联用仪（PerkinElmer，USA）。

气相色谱条件f超纯水洗针进样）：FFAP色谱柱（Agilent Technologies，USA）；进样口温度：240 ℃，氢火焰离子化检测器温度300 ℃，载气为高纯氦；进样量为0.6μL；柱流量为2 mL/min；程序升温：柱温为60 ℃，恒温3 min，以2 ℃/min升至180℃，恒温20 min.总用时问83 min；不分流模式进样。

质谱条件：质谱接口温度为260 ℃，离子源温度200℃：电轰击电离方式；电子能量70 eV；扫描质量范围30～430 amu：溶液延迟时间为5mln：进样量lμL；传输线温度200℃。

1.4

种子的致敏及萌发

取籽粒饱满的种子用自来水漂洗，经10%NaCl0消毒10 min后用无菌蒸馏水冲洗7次。蒸馏水和不同浓度的BCD作为致敏液将小麦种子浸泡2h进行致敏，共l8批。取同批致敏一致的种子150粒，整齐摆放到3个直径为12 cm的培养皿中（铺有1层滤纸），每皿50粒，各加入10 mL，Hoagland's培养液。其中，用蒸馏水致敏的空白对照组 （control cheCk 1，CKl）和（1、5、10、15、20）‰BCD组不加NaCI；用蒸馏水致敏的模型对照组（control check 2，CK2）和（10、20、30、40、50）‰ BCD组分别培养在NaCl浓度为125 mmol/L（盐敏感临界浓度）的改良Hoagland's培养液中；共24组。用恒温培养箱进行培养，昼夜温度分别保持在16～26℃和10～16 ℃，平均光周期为14 h。每天用称重法在培养皿中注水补充蒸发失去的水分，保证盐浓度的恒定。

1.5 测定指标

1.5.1 发芽率及胚芽鞘、胚根长度的测定

种子胚根长度超过种子长度的1/2作为种子发芽的标准。分别在培养12、24、36、48、60、72 h后从各组随机取12颗发芽种子测定胚芽鞘长，计算胚芽鞘的相对伸长速率（relative elongationrate，RER）。RER=L2-L1/△t，式中L2为后一次的测量值（mm），L1为前一次的测量值（mm），△t为时问间隔（h）。72 h后同时计算发芽率.测定胚根长一发芽率=发芽种子数/供试种子数×100%。

1.5.2 胚芽鞘、胚根鲜重和干重的测定

在培养72 h后从各组随机选取发芽种子测定胚芽鞘、胚根鲜重和下重。用蒸馏水清洗胚芽鞘和胚根，并用滤纸擦干，用电子天平称取鲜重后，装于纸质口袋中，置于70 ℃烘箱中至恒重后称其干重，

1.5.3

胚芽鞘有机小分子物质含量的测定

在培养72 h后从各组随机选取发芽种子参照文献的方法测定胚芽鞘中脯氨酸、可溶性糖和丙二醛的含量。

1.5.4 胚芽鞘中离子含量的测定

根据参考文献的方法测定胚芽鞘中K+、Na+的含量。

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结果与分析

2.1 BCD的GC-MS分析结果

经多次优化条件，初步得到BCD的气质联用图谱（图1），结果显示BCD中至少含有9种物质（表2）。大部分化合物对植物种子萌发的影响及其抗盐性未见文献报道，但它们结构中多含有羟基、羧基、羰基等活性基团，植物对这些小分子有机物的吸收和积累可以提高细胞渗透压，增强植物抗盐能力。其中，化合物（1）和（8）即乙酸和丙酸可以抑制细菌和真菌生长，这有利于植物良好生长环境的建立。化合物（3）尿素可以为植物的生长提供氮源，促进细胞的分裂和生长，提高植物抗逆性。分析表明，这些化合物具有潜在的抗盐性它们单独对小麦种子萌发的影响和抗盐性，以及相互之间的关系将是本课题之后的研究重点，

2.2 小麦种子盐敏感临界浓度的确定

由图2可知，相较于CK1处理，低浓度NaClf≤100 mnlol/L）处理小麦种子发芽率变化较小，而高浓度NaCl（≥150 mmol/L）处理时发芽率下降迅速，降至20%以下。我们选择中间浓度125 mmol/L继续进行试验，发现该浓度下小麦烟农19和鲁原301第3天的平均发芽率分别为52.3%和54.5%，该浓度为较佳的盐处理浓度，称该浓度为小麦种子的盐敏感临界浓度。

2.3 BCD对小麦胚芽鞘RER的影响

由图3可知，烟农19和鲁原301的CKI组胚芽鞘RER最大值都出现在第48 h，CK2组RER最大值推后，出现在第60 h，且约为CK1组的2/3，表明盐胁迫下胚芽鞘的伸长受到明显抑制，在无盐胁迫下，两种小麦的（1、5、10、l5）‰BCD处理组相较于CK1组RER有所增加，且10‰ BCD组的RER最大值出现的时间提前到第36 h。相较于CK1，烟农19的20‰ BCD组RER有所降低，鲁原301的变化不明显：在盐胁迫下两种小麦的（10、20、30、40）‰ BCD处理组相较于CK2组RER有所增加，且40‰ BCD组的RER最大值出现的时间提前剑第48h。相较于CK2，烟农19的50‰ BCD组RER有所降低，鲁原301的变化不明显。鲁原301在48 h之前RER高于烟农19，而在48 h之后有一半数值低于烟农19，其中有2/3出现在BCD处理组。这说明BCD处理组在48 h之前对鲁原301胚芽鞘伸长的作用优于对炯农19的作用，而在48 h之后对两者RER的作用逐渐接近。由此可见BCD能促进小麦胚芽鞘的伸长，同时具有缓解盐对胚芽鞘伸长的抑制作用，但对不同品种小麦作用效果不同.这可能跟小麦的品质有关。

2.4 BCD处理对小麦种子发芽率、胚芽鞘胚根长度的影响

从表3可以看出，无盐胁迫下，两种小麦的l～15‰ BCD处理组发芽率、胚芽鞘和胚根的长度大多数高于空白对照组（CKl），其中l0‰ BCD处理组效果最明显，炯农19的这3个生理指标分别增加了（4.3、20.7、l7.1）%，鲁原301分别增加了（5.6、16.6、13.4）%，烟农19胚芽鞘和胚根长度的增幅均高于鲁原301。20‰ BCD处理对烟农19的这3个生理指标有明显的抑制作用，其中对发芽率极显著抑制（P

2.5 BCD处理对小麦胚芽鞘和胚根鲜重、干重的影响

从图4可以看出，无盐胁迫下，两种小麦的BCD处理组与空白对照组相比胚芽鞘和胚根的鲜重、干重大部分均有所增加，其中lO‰ BCD组增加幅度最大，烟农19的胚芽鞘鲜重、干重，胚根的鲜重、干重分别增加了（10.74、19.O、8.2、28.0）%，鲁原301的这4个指标分别增加了（11.0、19.5、7.2、l 8.2）‰。鲁原301胚芽鞘的鲜重、干重增幅大于烟农19，胚根的鲜重、于重增幅小于烟农19；盐胁迫下，两种小麦的BCD处理组同对照组相比胚芽鞘和胚根的鲜重、干重大部分有所增加，其中40‰ BCD组增加幅度最大，烟农19的胚芽鞘鲜重、干重，胚根的鲜重、干重分别增加了（13.3、18.6、14.0、37.1）%，鲁原301的这4个指标分别增加了（15.9、24.4、10.4、35.1）%。鲁原301胚芽鞘的鲜重、干重增幅同样大于烟农19，胚根的鲜重、干重增幅小于烟农19。以上结果表明，在无盐及盐胁迫下BCD处理对鲁原301胚芽鞘的促进作用均强于对烟农19胚芽鞘的作用，对胚根的促进作用弱于对烟农19胚根的作用。

2.6 BCD处理对小麦胚芽鞘脯氨酸和可溶性糖含量的影响

从图5可以看出，兀盐胁迫下，BCD处理相较于空白对照（CKl）两种小麦的脯氨酸和可溶性糖含量都逐渐增大，其中lO‰ BCD处理效果最好。烟农19胚芽鞘的脯氨酸和可溶性糖含量分别增加了37.5%和48.7%，鲁原301胚芽鞘的这两种物质的含量分别增加了57.2%和50.4%，增加幅度均大于炯农19。20‰ BCD处理组，烟农19胚芽鞘的这两种物质没有增加反而降低.鲁原301依然有所增加或增加很少；盐胁迫下，BCD处理相较于模型对照（CK2）两种小麦的脯氨酸和可溶性糖含量也都逐渐增大，其中30‰ BCD处理效果最好，烟农19胚芽鞘的脯氨酸和可溶性糖含量分别增加了36.5%和27.2%，鲁原301胚芽鞘的这两种物质的含量分别增加了19.7%和45.8%，其中可溶性糖含量增幅大于烟农19。50‰BCD处理后，烟农19胚芽鞘的这两种物质没有增加反而降低，鲁原301依然有所增加或降低很少。从以上结果看出，相较于烟农19，BCD更有利于鲁原301胚芽鞘脯氨酸和可溶性糖含量的增加。同时可以看到较高浓度BCD组鲁原301胚芽鞘脯氨酸和可溶性糖含量依然有少量增加或降低很少。

2.7 BCD处理对小麦胚芽革肖中K+、Na+和MDA含量的影响

由表4可以看出，无盐胁迫下，两种小麦的BCD处理组相较于空白对照组K+含量逐渐升高，Na+和MDA含量逐渐降低。其中loo/oo BCD处理组变化最明显，烟农19和鲁原301的K+含量分别增加23.7%和42.1%，Na+含量分别减少了86.4%和91.6%， MDA含量分别降低了38.2%和58.6%，鲁原301的变化量均大于烟农19。20‰BCD处理对炯农19离子调节没有抑制并且使MDA含量有所降低；相较于无盐胁迫（CKl），盐胁迫下（CK2）两种小麦胚芽鞘的K+含量都明显降低，Na+和MDA含量都明显升高。两种小麦的BCD处理组相较于模型对照组K+含量逐渐升高，Na+和MDA含量逐渐降低。其中30%。BCD处理组变化最明显.烟农19和鲁原301的K+含量分别增加了9.9%和10.0%，Na+含量分别减少了28.0%和49.9%，MDA含量分别降低了52.2%和60.3 %，鲁原301的变化量同样均大于烟农19。烟农19的50‰ BCD处理组相较于CK2组，K+、Na+和MDA含量都降低，鲁原301K+含量增大，Na+和MDA降低。可见，在盐胁迫下，50‰ BCD依然有利于鲁原301进行离子调节和降低胚芽鞘中过氧化产物，而对烟农19的离子调节作用不明显，但有降低过氧化产物的作用。

3 讨论

很多禾谷类植物实验研究证明，种子萌发的好坏对最终的作物产量有很重要的影响。萌发期是禾谷类作物整个生长过程中耐盐性最薄弱的阶段之一，因此提高禾谷类作物萌发期的耐盐性具有重要意义。本实验中BCD处理减缓了盐胁迫对胚芽鞘伸长的抑制作用，将对该小麦品种整个生长发育产生重要影响。

盐胁迫下植物种子的萌发受土壤渗透胁迫的影响显著，土壤中盐分过多，使土壤水势降低，植物吸水困难，从而造成细胞缺水，萌发受到抑制而植物中碳水化合物的积聚有利于渗透调节植物通过主动增加细胞内溶物质降低细胞渗透势（如CK2处理），因而能从环境中继续吸收水分，这个过程就是渗透调节作用。本实验中，125 mmol/LNaCI处理相较于空门对照组，两种小麦胚芽鞘中Na+、脯氨酸、可溶性糖含量都明显升高，K+含量明显降低，这是小麦受到盐胁迫的表现。经BCD处理后Na+含量逐渐降低，脯氨酸、可溶性糖和K+含量逐渐升高，这有利于小麦发芽种子进行渗透调节，降低盐胁迫伤害作用。这与小麦发芽率、胚芽鞘RER、胚芽鞘和胚根的长度、鲜重、干重有明显的正相关性，与 MDA含量呈负相关性。30‰BCD对盐胁迫下两种小麦缓解盐胁迫的作用最好，但对不同的小麦品种促进作用不同，整体来看，BCD对鲁原301促进渗透调节和抗氧化的作用优于对烟农19的作用。50‰ BCD浓度较高，对烟农19的渗透调节大体有抑制作用，其原因可能是低浓度的BCD能激发该小麦品种的抗盐机制，而高浓度的BCD本身作为胁迫因子阻碍了种子的萌发；对鲁原301的渗透调节有少量的促进作用，可能是鲁原301抗环境胁迫能力比烟农19好。

BCD同样能促进无盐胁迫下两种小麦的萌发，最佳浓度为‰，比盐胁迫下最佳BCD浓度低很多。该浓度对鲁原301萌发的促进作用大体优于对烟农19的作用。20‰ BCD对炯农19种子萌发有部分抑制作用，对鲁原301大体有促进作用。

有研究表明FA克服了Fe从土壤溶液到植物根部扩散的限速步骤，Fe-FA作为肥料的效能远高于FeCl3，对于解决作物中的Fe缺乏有重要的意义，这与FA中化合物分子结构的羧基、酚羟基、醇羟基和醌基等基团与金属离子的络合作用有关。BCD可看做是FA混合物中易挥发的部分.其化合物相对分子质量更小，含有更多羧基、羟基等活性基团，在植物体中的扩散及离子调节更有优势，并且小研究预实验结果证实BCD促进植物种子萌发的作用优于FA，因此BCD对Fe及其他离子的转运作用值得进一步研究。植物体一般含有较高水平的抗氧化剂，不管是本身具有的还是外源物质诱导产生的，都会有增强植物抵抗环境胁迫能力的作用。在本实验中，BCD处理降低了盐胁迫下小麦胚芽中MDA的含量，缓解了盐胁迫对细胞的氧化损伤，这与栾白、郭伟等报导的结果一致，因此在本实验中作为FA较优级分的BCD很有可能充当了小麦抗氧化剂诱导剂。

在本实验中，BCD在极低浓度下表现出促进种子萌发和缓解盐胁迫对小麦生长抑制的作用，表明BCD是一种含小分子有机混合物的具有高效抗盐活性的溶液，适合开发为抗盐胁迫及调节植物生长的高级肥料或添加剂。本课题不仅能为小麦抗盐胁迫研究提供理论基础，还可以为合理有效地利用盐碱耕地提供有力的技术支持。