合成的哌啶并噻吩类化合物抑制肺癌细胞生长初步研究

韦杰 潘卉 赵扬 冯阳

摘 要：为了发现新的可用于肺癌治疗的小分子药物，从实验室现有的小分子化合物库中.选取13个未见报道的新型哌啶并噻吩类化合物，对其抑制肺癌A549细胞生长的作用进行初步评价 通过体外培养A549细胞.应用WST-】法检测小分子化合物（终浓度为10 μmol/L）处理后细胞存活率的变化，发现化合物11（噻吩并【2.3一c]哌啶-3-甲酰胺一2一（3一甲氧基一萘一2一羰基）一氨基]-6-苄基一.盐酸盐）能显著抑制A549细胞的生长，抑制率可达到（71.34+0，96）%。对小分子化合物结构与活性关系的分析发现苯并结构可能是增强化合物对A549细胞生长的抑制作用的关键结构基团。随后.进一步分析了化合物11（终浓度分别为I、2.5、5、10μmol/L）对A549细胞和正常人胚肺成纤维MRC-5细胞生长的抑制作用 结果表明，随着该化合物浓度增加，对A549细胞生长的抑制率逐渐增大，用GraphPad Prism软件计算出该化合物的IC50为2.407μmo1/L；而该化合物对MRC-5细胞生长的抑制率显著低于对A549细胞生长的抑制率.当作用终浓度为10 μmol/L时，其对MRC-5细胞生长的抑制率也只有30.41%。这些研究结果初步显示化合物11是一种新的较为理想的治疗肺癌药物先导化合物的候选分子

关键词：肺癌；A 549细胞：MRC-5细胞；细胞生长；哌啶并噻吩：结构活性关系

中图分类号：Q279

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2014）05-0382-05

肺癌是世界范围内发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤之一。近年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性肺癌发病率和死亡率占女性所有恶性肿瘤的第二位[1]。肺癌的治疗方法主要有手术治疗、放射治疗、药物治疗、靶向治疗、综合治疗等，药物治疗及靶向治疗在其中占据了重要的地位[2]。目前，临床上常用的治疗肺癌的药物有贝伐单抗、西妥昔单抗、长春新碱等，虽然这些药物对肺癌有一定的疗效，但也存在着很大的毒副作用及机体对药物的极大的耐药性问题，因此，开发疗效显著、靶向性强、毒剐作用小的新型治疗药物显得尤为重要[3]。

化学合成的有机小分子是一种相对分子质量小、容易进入细胞、可以与其中的蛋白质分子结合并影响蛋白活性的一种化合物。在抗肿瘤药物的筛选中，这种小分子化合物也得到广泛的应用，筛选有活性的小分子化合物是其中的第一步。一口.筛选到活性化合物，该化合物就被视为可能的药物先导化合物，后续可进行结构修饰、药理学研究、药代动力学分析等药物开发的相关研究工作。、此外，就算筛到的活性化合物不适合作为药物开发对象，进一步寻找该化合物的作用靶点及作用机制，电可发现一些与肿瘤发生发展相关的重要的新的基因，从而为药物研发提供新的靶点，因此也是具有重要意义的[4，5]。在20世纪八九十年代，快速合成结构多样的有机小分子的技术发腱成熟，随后商业化的小分子化合物大量出现，为抗肿瘤药物筛选及肿瘤发生机制的研究提供了丰富的资源[6]。

在医药的研究发展过程中，含氮杂环化合物因其具有独特的生物活性、低毒性等，常被作为医药创制的基本结构单元[7-9]1。为了寻找高活性的新型化合物，本研究从实验室现有的小分子化合物库中选取13个含有哌啶并噻吩为母核，成氯盐，目前国内外文献未见报道的新型化合物，在体外培养肺癌A549细胞中，研究其对细胞生长的抑制作用；并分析了化合物结构与活性之问可能存在的关系。对活性最高（对A549细胞生长的抑制率最高）的化合物进行了抑制A549细胞生长的浓度依赖效应分析及对正常人胚肺成纤维MRC-5细胞的生长抑制作用研究。

1 材料与方法

1.1 材料

人肺癌细胞系A549由昆明理工大学医学院张继红老师馈赠，正常人胚肺成纤维细胞系MRC-5购自中国科学院昆明动物研究所细胞胞库，小分子化合物购自Life Chemicals。研究中所用主要试剂包括：改良型RPMI-1640培养荩fIIv一clone）、DMEM培养基（Hyclone）、胎牛血清（Scien—Cell）、特级胎牛血清（Gibco）、青链霉素混合液液（So一larbio）、胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio）、二甲基亚砜（DMSO，Solarbio）。WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（碧云天生物技术研究所）。

1.2 细胞培养

从液氮罐中取出细胞，复苏后置于6 cm直径的细胞培养皿中，放在37 ℃、5% C02条件下的细胞培养箱（Thermo）中培养。A549细胞完个培养基包括改良型RPMI-1640培养基、10%的胎牛血清（ScienCell）、1%的青链霉素混合液；MRC-5细胞完全培养基包括DMEM培养基、15%的特级胎牛血清（Gibco）、1%的青链霉素混合液。复苏后生长状况良好的细胞，传代至10 cm直径的细胞培养皿中扩大培养，以备后续试验使用。选取生长状态良好处于对数生长期的细胞接种于96孔板，用于小分子化合物活性检测试验。

1.3 .13 个小分子化合物对A549细胞生长的抑制作用分析

将处于对数生长期的A549细脆，接种于96孔板，铺板密度为2xl04 cells/mL，即每孔为2000个细胞，体积为100 μL。细胞接种24h后，向其中分别加入各小分子化合物（终浓度为10μmol/L）体积为1μL，对照孔中加入等体积的DMSO（终浓度为0.5%），每个处理设3个重复（每个小分子及DMSO均分别处理3个孔的细胞），再补加细胞完全培养基100 μL。小分子化合物处理48 h后，每孔加入WST-1溶液20 μL，在培养箱内继续孵育2～4 h，然后用酶标仪在450 nm波长处测定吸光值，所得数据用于结果分析。1.4 小分子化合物11抑制A549细胞生长的浓度依赖效应分析及对MRC-5细胞生长的抑制作用分析

将处于对数生长期的A549细胞和MRC一5细胞，接种于96孔板，铺板密度为2x104 cells/mL，即每孔为2 000个细胞，体积为100 μL。细胞接种24 h后，向其中分别加入不同浓度的化合物1 1（噻吩并[2， 3-c]哌啶-3-甲酰胺一2一[（3一甲氧基一萘-2-羰基）一氨基卜6-苄基一，盐酸盐；Thieno[2，3 -c] piperidine一3-carboxamide -2 -[（3 -methoxy -naphthalene -2 -carbonyl） -amino] -6 -（benzyl） -，hy-drochloride）（终浓度分别为1、2.5、5、10 μmol/L），体积为1μL，对照孔中加入等体积的DMSO （终浓度为0.5%），每个处理设3个重复（不同浓度的小分子及DMSO均分别处理3个孔的细胞），再补加细胞完全培养基100 μL。小分子化合物处理48 h后，每孔加入WST-1溶液20 μL，在培养箱内继续孵育2～4 h，然后用酶标仪在450 nm波长处测定吸光值，所得数据用于结果分析。该化合物抑制A549细胞生长的IC50值用GraphPad Prism软件计算。

2 结果与分析

2.1 13个小分子化合物对A549细胞生长的抑制作用

本研究所用的13个化合物是具有相同核心结构（图1）的类似物，并成氯盐。因其核心结构含哌啶并噻吩结构，所以我们暂时把这一类小分子命名为哌啶并噻吩类化合物。核心结构中的R1、R2代表不同的结构基团。化合物1～4的Rl结构基团为甲氧羰基，5—8的R1结构基团为氰基，9～13的R1结构基团为氨甲酰基（表1）。

用化合物（终浓度10 μmol/L）处理A549细胞48 h后，用WST-1法检测细胞的存活情况，通过与对照细胞（DMSO）的存活情况进行比较，来计算各化合物对A549细胞生长的抑制率（表1）。R1结构基团均为甲氧羰基的化合物中，对A549细胞生长的抑制率最高的是化合物4，抑制率为（26.58+3.65）%；R1结构基团均为氰基的化合物中，对A549细胞生长的抑制率最高的是化合物7，抑制率为（46.59+8.68）%；R1结构基团均为氨甲酰基的化合物中，对A549细胞生长的抑制率最高的是化合物11，抑制率为（71.34+0.96）%。2.2 小分子化合物11抑制A549细胞生长的剂量效应及对MRC-5细胞生长的抑制作用

13个小分子化合物中对A549细胞生长抑制率最高的化合物1 1，我们又进行了不同浓度的化合物11对A549细胞和MRC-5细胞生长的抑制作用分析。结果显示，该化合物对A549细胞生长的抑制作用具有明显的浓度依赖效应，A549细胞的存活率随化合物11浓度的增加而逐渐降低，在终浓度为10 μmol/L的时候，抑制率达到最大。用GraphPad Prism软件计算出该化合物抑制A549细胞生长的1C50为2.407 μmol/l.。虽然MRC-5细胞的存活率也随化合物11浓度的增加而有所降低，但终浓度为10 μmol/L时，其对MRC-5细胞生长的抑制率也只有30.41%（图2）。

由此可见，化合物11对A549细胞生长的抑制作用是一种特异的作用，而非简单的细胞毒性，同时该化合物对MRC-5细胞生长的抑制率远小于对A549细胞生长的抑制率，这些特征都暗示我们该化合物或许可作为治疗肺癌药物先导化合物来进行药物研发。

3 讨论

A549细胞系是1972年由GJiard等从58岁的白种男性的肺腺癌组织移植，通过体外培养建立的细胞系，一方面具有Ⅱ型肺泡上皮细胞的形态及特性，另一方面表现出典型的肺腺癌细胞恶性特征。因此，A549细胞系被广泛用于抗肺癌药物筛选及其他肺癌相关研究中。

本研究中，检测细胞存活情况采用的是WST-1法。WST-1是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其他MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点，具有快速、简便、准确等特点。首先，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的甲瓒（formazan）不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-1和XTT、MTS产生的甲瓒都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤；其次，WST一1产生的甲瓒比XTT和MTS产生的甲瓒更易溶解；再次，WST-1比XTT和MTS更加稳定，使试验结果更加稳定。另外，WST-1和MTT'、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高；是体外筛选抗癌新药的可靠方法。

含氮杂环母核的化合物一直是研究的热点，但目前哌啶并噻吩类化合物研究相对较少，只有曾国平等报道9个合成的未见报道的新型哌啶并噻吩并嘧酮衍生物中，部分化合物有较好的抑制黄瓜灰霉、水稻纹枯、小麦赤霉菌生长的活性，本研究所筛选的化合物是13个未见报道的哌啶并噻吩类化合物.在体外培养A549细胞，利用W-ST-1法检测化合物处理后细胞存活率的变化，发现了部分化合物能不同程度抑制A549细胞生长，其中化合物II对A549细胞生长的抑制效率最高，但对正常MRC-5细胞牛长的抑制作用显著低于对A549细胞生长的抑制作用，这一新的发现也为肺癌治疗药物的开发提供了新的思路。

通过对13个小分子化合物结构与活性之间可能存在的关系进行分析，发现Rl结构基团为甲氧羰基的4个化合物中，化合物4的活性最高，化合物1、2、3活性相对较低的原因可能是R2结构基团相对大.导致空间阻力大，使得与受体结合不够强：Rl结构基团为氰基的4个化合物中，化合物5、6、7的活性差不多，其中化合物5、6可能因为R2结构基团有苯并杂环结构，化合物7需要待一步研究；R1结构基团为氨甲酰基的4个化合物中，化合物Il的活性最高，可能因为其R2结构基团有苯并结构及苯环结构的完整性。化合物结构与活性之问关系的初步分析也为以后的化合物结构优化设计及计算机辅助药物筛选提供了一定的思路。

化学遗传学（chemical genetics）是在20世纪90年代发展起来一门交叉学科。其主要思路就是利用小分子化合物来干扰细胞内的生物学过程，从而鉴定参与这些生物过程的新的生物大分子。在本研究中我们发现的对A549细胞生长有显著抑制作用的化合物11也可用于后续的肺癌发生机制的化学遗传学研究中。通过寻找该化合物在A549细胞巾可能作用的信号通路及作用的靶蛋白.可揭示新的肺癌发生的相关机制，同时还可为治疗肺癌的新药研发提供新的靶点。

总的来说，本研究发现了一类新的可抑制肺癌A549细胞生长的小分子化合物，并发现其影响化合物活性的可能关键结构基团。其中化合物11对肺癌_A549细胞生长的抑制作用最强，但对正常MRC-5细胞生长的抑制作用较低，是一个较理想的新的治疗肺癌的药物先导化合物。此外，化合物11还可用于肺癌发生机制的化学遗传学研究，可发现一些新的针对肺癌的药物设计的靶点。