代谢性标记结合二维电泳寻找O—糖基化蛋白的研究

申浩 张秀 张蕾 张延

摘 要：蛋白质的o-糖基化（O-glycosylation）是一种重要的翻译后修饰，参与诸多生理和病理过程。目前，对于蛋白质的O-糖基化的研究进展仍非常缓慢，一个重要的原因就是缺乏高效的对O-糖基化蛋白进行分离和鉴定的技术。创新性地将点击化学反应、二维电泳和质谱技术结合，对寻找细胞内0-糖基化蛋白进行了技术探索性研究。首先利用代谢性标记手段，在人肝癌细胞HCCLM6培养基中加入四乙酰化叠氮半乳糖胺（Ac4GaINAZ）对细胞内O-GalNAc糖基化蛋白进行标记：其次通过点击化学将炔基荧光基团连接至标记的O-糖基化蛋白的叠氮基团；应用二维电泳技术对标记蛋白进行分离，并找到13个具有荧光信号的蛋白点；最后对具有荧光信号的蛋白进行质谱鉴定，成功鉴定到7种蛋白，经软件预测后，GRP78蛋白和ANXA1蛋白均具有潜在的0-糖基化位点。这为寻找细胞或生物体中的O-糖基化蛋白奠定了基础，并为高通量筛选O-糖基化蛋白提供技术平台。

关键词：O-糖基化蛋白；点击化学；二维电泳；质谱技术

中图分类号：Q599

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2014）05-0377-05

糖基化是一种常见的蛋白质翻译后修饰，存在于生物体内超过一半的蛋白质中。糖基化修饰对于蛋白质的结构和功能具有显著影响，参与调节信号传导、分子转运、细胞粘附、免疫应答等牛物学过程.除此之外，异常的糖基化修饰与诸多疾病有密切关系，粘蛋白型O-糖基化是一类广泛仔在的蛋白质糖基化修饰，其合成的第一步为：UDP-乙酰氨基半乳糖（UDP-GalNAc：，供体）通过多肽N-乙酰氨基半乳糖基转移酶（pp-GalNAc-Ts）的催化连接在蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基（受体）的羟基氧上。由于缺少保守的O-糖基化氨基酸特征序列，缺乏通用的糖苷酶以及O-糖链结构的复杂性等原因，目前对于蛋白质O-糖基化的分析仍处于方法开发阶段。生物正交点击化学（bioorthogonalClick chemistry）可经简单的叠氮一炔基环化加成反应将含炔基检测标签共价连接到生物兼容的叠氮标记的待测分子上。凭借其生物相容性、生物正交性、高效性和高特异性等优点.此类新兴技术在化学糖生物学领域发展迅速[10，11]。基于叠氮的生物正交点击化学在糖生物学研究中的应用，主要分为以下几个方面：1）在糖代谢过程中的应用。在糖代谢研究的早期.Reutler教授开发了代替唾液酸的非天然N-酰基类似物，为唾液酸的研究提供了新思路。近10年来.Bertozzi教授利用施陶丁格反应进行糖代谢的研究，进一步推动了生物正交点击化学的发展：2）在糖链活体成像中的应用。目前，AC4ManNAz，AC4GalNAz和GDP-FucAz均成功地应用于糖链活体成像研究中；3）在糖链富集和糖组学中的应用。 NarimatsU教授将生物正交点击化学与质谱技术结合，成功的鉴定出岩藻糖基化的N -聚糖位点图谱。此外，本课题组开发的一种以二硫键和末端炔基修饰的二氧化硅纳米颗粒，可从多肽混合体系中特异性地富集叠氮标记的多肽：4）在病毒研究中的应用。可用叠氮或炔基修饰病毒表面.有利于成像和药物传送；5）另外，生物正交点击化学在蛋白活性表达谱，糖复合物合成以及糖芯片技术中也有广泛的应用。

本研究利用叠氮标记的单糖类似物——Ac4GaINAz（图1）对人肝癌细胞系HCCLM6进行代谢性标记，单糖类似物进入细胞内参与正常糖代谢过程.可使细胞内的O-糖基化蛋白标记上叠氮基团，再通过叠氮和炔基的点击化学反应实现对蛋白的荧光标记，最后，利用二维电泳技术将蛋白进行分离以及MALDI—T0F质谱对蛋白进行鉴定（实验流程见图2）。本研究为寻找O一糖基化蛋白建立了良好的技术平台，为蛋白质O-糖基化的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

人肝癌细胞系HCCLM6南人类基因组南方研究中心张新教授惠赠。

1.1.2 相关试剂

胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）购白美国GIBCO公司；胰蛋白酶消化液（Try psin）和AlexaFluor 555荧光试剂（炔基荧光试剂，Alkynyl fluophor）购自美国Life technology公司；细胞裂解液成分为：1% NP-40，50 mmoUL Tris-HCL 150 mmoI/lNaCl， 0.1% SDS，Cocktail；细胞培养基DMFM/HICJH GLUCOSE、BCA定量试剂盒和蛋白 Marker购白美国Thermo公司；四乙酰化叠氮半乳糖胺（AC4GalNAz）由本实验室工胜老师合成；CuSO4、NaVc购自国药集团化学试剂有限公司；IPG胶条、两性电解质Bio-Lyte和矿物油购白美国Bio-Rad公司；TBTA、DTT和IAA购自美国Sigma公司；配制水化液所用试剂、平衡缓冲液所用试剂、12.5%丙烯酰胺凝胶所用试剂均为进口或国产分析纯试剂；水化上样缓冲液成分：水化液，DTT和Bio-Lyle；平衡缓冲液I成分：平衡液，DTT和溴酚蓝；平衡缓冲液Ⅱ成分：平衡液，IAA和溴酚蓝、

1.1.3 仪器

等电聚焦仪和垂直电泳仪（美国Bio- Rad公司）。荧光化学发光及同位素影像扫描分析仪（fluorescent and radioisotope science imaging sys-tems，，FLA-5100，日本Fujifilm公司）；平板扫描仪（台湾UMAX公司）；MALDI-TOF质谱仪（Ultrallex

1.2 实验方法

1.2.1 细胞标记

HCCLM6细胞培养于37℃，5% C02培养箱，DMEM（含 10% FBS）培养基，待细胞生长进入指数生长期；取50 μL浓度为10 mmol/L的AC4Gal-NAz加到培养皿底部，待溶剂乙醇挥发，将Sxl06个细胞铺于培养皿中，使标记终浓度为100μmol/L；培养细胞48h。

1 .2.2 蛋白样品的获得

细胞标记48h后，吸掉培养基并进行胰蛋白酶消化，将细胞转移至离心管中，800 r/min离心收集细胞；加入150 μL细胞裂解液震荡裂解，12 000g离心30min，保留上清；BCA蛋门定量试剂盒进行蛋白定量。

1.2.3 叠氮一炔基环化加成反应

定量后取300 μg总蛋白，加入1.5 μL AlexaFluor 555荧光试剂和2μL催化剂，并用PBS（pH 7.8）补齐至400μL，置于恒温震荡仪中25℃反应1 h；反应结束后，甲醇氯仿法进行蛋白沉淀：样品中加入1.2 mL甲醇并混匀，加入300 μL氯仿并混匀，加入800 μL超纯水并混匀，15 000 g离心5 min弃上清，加入900 μL甲醇后15 000 g离心5 min，弃上清，空气中风干蛋白沉淀。

1.2.4 等电聚焦

用水化上样缓冲液将样品定容至300 μL；IPG预制胶条室温放置5 min；沿电泳槽边缘连续加入样品.不要产生气泡；去除预制IPG胶条上的保护层，将IPG胶条置于样品中；胶条上覆盖1 mL矿物油：进行等电聚焦电泳。

等电聚焦电泳仪参数没置：溶胀上样阶段：

50 V

12 h等电聚焦阶段：

200 V

1h

快速升压

500 V

1h

快速升压

1 000 V

2h

慢速升压

10 000 V

2h

慢速升压

10 000 V 80 000 Vhrs 快速升压

500 V

Hold

快速升压

1.2.5 SDS-PAGE电泳

等电聚焦结束后，沥干胶条上的矿物油，置于平衡缓冲液I中平衡I5 min；平衡缓冲液Ⅱ中平衡15 min；去离子水清洗残余的缓冲液，进行SDS-PAGE电泳。

电泳仪参数设置：阶段I：16 mA/gel 30 min阶段Ⅱ：24 mA/gel 6 h

1.2.6

荧光扫描与考马斯亮蓝染色

对凝胶进行荧光扫描，采集荧光信号，获得荧光信号二维电泳图；对平行凝胶进行考马斯亮蓝染色，脱色后扫描获得二维电泳图谱。

1.2.7 MALDI-TOF质谱

比对荧光信号二维电泳图谱结果与考马斯亮蓝染色结果，对具有荧光信号的蛋白进行收集；进行质谱分析。

2 结果与分析

2.1 荧光信号二维电泳图谱

利用荧光化学发光及同位素影像扫描分析仪对二维电泳凝胶进行荧光信号扫描。结果如图3所示。结果显示，荧光信号大部分出现在pH碱性端，相对分子质量40 kD附近；少部分信号出现在pH酸性，相对分子质量15 kD附近。

2.2 二维电泳图谱

荧光信号扫描以后，对同一块二维电泳凝胶进行考马斯亮蓝（CBB）染色，脱色后用平板扫描仪进行扫描。结果如图4所示。

2.3 质谱鉴定结果

对荧光信号二维电泳图谱和考马斯亮蓝染色图谱进行比对，寻找到13个具有荧光信号的蛋白点（如图4所示）。对其进行割胶和质谱鉴定，成功鉴定到7种蛋白，如表1所示。我们用Net0-Glyc 3.1 Server软件对7种蛋白的O-糖基化位点进行预测，其中GRP78蛋白和ANXA1蛋白分别具有2个和1个潜在的O-糖基化位点。

3 结论与讨论

点击化学具有生物相容性、高特异性等优点，已逐步发展为极有价值的化学生物学研究方法。尤其是在糖生物学领域，点击化学技术在高通量糖蛋白质组学和疾病相关标志物寻找等方面发挥了重要作用，叠氮试剂因其生物学惰性，在体外实验和体内实验（例如，小鼠和斑马鱼）中均有很大突破，应用也最为广泛。灵敏的选择性和生物相容性使生物正交点击化学为糖生物学研究带来了巨大变革，基于生物正交性点击化学的糖生物学研究主要包括四个方面：1）利用叠氮的反应活性和特异性，作为捕获底物的工具；2）用于新型生物正交性官能团的发现；3）在高通量蛋白质组学中的应用；4）对疾病发生发展机制的研究。目前，对于O-糖基化蛋白的发现依然基于凝集素富集技术，受限于凝集素特异性和灵敏度较差等缺点，尤其是在研究复杂糖链的过程中，这种技术思路存在较大的局限性。为建立高通量的寻找O-糖基化蛋白的技术，本研究将二维电泳技术与点击化学技术相结合，并对利用糖探针标记所发现的潜在的0—糖基化蛋白进行了质谱鉴定，所发现的部分蛋白经糖基化预测软件分析发现其预测含有O-糖基化修饰位点。虽然目前的技术无法判定确定的糖基化修饰位点，但是本研究仍为O-糖基化蛋白的高通量发现提供了有效的技术策略。今后通过改善和优化标记糖蛋白的富集效率、总蛋白的分级分离能力等，将能进一步提升荧光信号的灵敏度与O-糖蛋白的展现特异性，从而更加完善该技术。