不同伤害性刺激致大鼠痛感觉与痛情绪的比较

汪伟伟 刘菊 蒋雪丽 张森 方博文 刘伟 黄宏平 汪萌芽

摘 要：为比较不同伤害性刺激致大鼠痛感觉与痛情绪的差异，对17只麻醉SD大鼠进行痛感觉代表脑区异颗粒区（dysgranular zone，DZ）和痛情绪代表核团基底外侧杏仁核（basolateral amygdala，BLA）电活动，与心电、呼吸肌肌电、皮肤电导、体温的同步心理生理学记录，按顺序均衡法分别给予热、夹尾和电刺激观察到热和夹尾刺激增强BLA和DZ.而电刺激仅增强DZ的放电活动，且热刺激所诱发的BLA与DZ放电活动均强于夹尾和电刺激所诱发的活动（P<0.05）。BLA与SZ的基础放电频率呈正相关（P<0.05），夹尾刺激后相关性增高（P

关键词：伤害性刺激：痛感觉；痛情绪；异颗粒区（DZ）；基底外侧杏仁核（BLA）

中图分类号：R441.1

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2014）05-0411-07

世界卫生组织将疼痛确定为继血压、呼吸、脉搏、体温之后的“第五大生命体征”，但疼痛的心理生理学机制尚不清楚。1994年国际疼痛研究会（international assoCiation for the study pain， IASP）将疼痛定义为：“一种组织损伤或潜在损伤相关的不愉快的主观感觉和情绪体验”。此定义说明疼痛包括痛感觉和痛情绪两方面。疼痛发生过程中既有痛感觉传导通路又有痛情绪的传导通路，以往在研究大鼠接受不同伤害性刺激时脑内核团的脑电活动变化存在相似和不同的争议。究其原因可能还是各研究者在核团及伤害性刺激种类选取上存在差异所致。在猴的研究中已表明伤害性刺激会特异性引起第一躯体感觉皮层中的3a区域发生反应，在后续研究中又发现大鼠脑中异颗粒区（dysgranular zone，DZ）与猴脑中3a区域具有类似的功能，但不同伤害性刺激在大鼠DZ区域是否诱发差异性反应，尚未见报道。已有文献报道，痛情绪反应过程中基底外侧杏仁核（baso-lateral amygdala，BLA）起到非常重要的作用。另外，在人类情绪的心理生理学研究中也特别重视对情绪相关的自主性生理反应的观察，因为这些自主性生理变化和情绪之间存在着显而易见的联系。如研究表明，心率、皮肤电反应、血压等都是反映情绪变化的有效指标。疼痛往往伴有抑郁情绪的发生，在有抑郁症状的患者中有大部分同时具有疼痛症状。同时神经解剖学证明，很多参与疼痛形成的脑区，同时也参与自主神经系统的调节。为此，利用心理生理学技术，给予大鼠不同伤害性刺激（热刺激、夹尾刺激、电刺激），采集疼痛过程中的核团放电、呼吸肌肌电、体温、心电、皮肤电导等指标来反映疼痛过程中的痛感觉和痛情绪的发生过程，观察和比较痛情绪代表核团BLA和痛感觉代表核团DZ的放电活动及其相关性，以及各项外周生理指标变化的异同。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选用250—300 g成年SD雄性大鼠17只，由南京青龙山动物繁殖场提供。

1.2 仪器设备及药品

常规动物手术器械如血管钳式夹尾仪、电针、温度计，双层铜网电生理屏蔽罩和防震台，脑立体定位仪（上海奥尔科特生物科技有限公司）、手术显微镜、牙科钻和保温毯。不锈钢同芯金属电极、金属参考电极和微电极放大器，PowerLab八通道生理信号采集与处理系统（PowerLab System，AD Instruments，Australia）及其Chart Pro记录和分析软件，20%氨基甲酸乙酯（国药集团化学试剂有限公司）、75%医用酒精（德州安捷高科消毒制品有限公司）等。

1.3 实验方法

1.3.1 动物麻醉

术前晚给实验大鼠禁水禁食处理，1.5 mL/kg20%氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉稳定后将大鼠固定于脑立体定位仪，下垫恒温37.O℃保温毯，放置在双层铜网电生理屏蔽罩内的防震台上。

1.3.2 多项生理指标记录

将针式电极插入大鼠右前肢腕关节上部的前臂皮下，左后肢踝关节上部的小腿皮下，右后肢接地，记录标准肢体Ⅱ导联心电图。在大鼠肛门内放置体温换能器探头并用医用胶布同定，进行体温信号采集。以2根针式电极插人大鼠右侧腋中线第9肋下缘肋间外肌内，记录呼吸肌肌电图。将两块板式皮肤电导电极，用医用胶布分别固定于大鼠左前掌背面和腹面，记录皮肤电导信号。

1.3.3 脑部双核团细胞外记录

调节耳杆使左右对称，上下移动门齿杆使大鼠颅骨处于同一水平面，固定大鼠头部使之不能移动。用手术刀切开头皮，3%H202擦拭充分止血，暴露颅骨标志（前囟、人字缝）。调节前囟、人字缝到同一水平平面。定位：异颗粒区（DZ）：前囟后（AP），0.48—-3.3 mm；旁开（L），3.5～4.6 mm；硬膜表面以下（DV），0.8—3.0 mm；基底外侧杏仁核（BLA）：前囟后（AP），-1.56—-3.36 mm；旁开（R），3.9～4.6mm；硬膜表面以下（DV），7.8—8.82 mm。用牙科钻钻颅开窗，手术显微镜下用显微剪剪开硬脑膜、蛛网膜和软脑膜，3% H202充分止血。使用金属电极在操作臂的牵引下移至颅窗上，并紧贴脑组织，2%生理盐水琼脂封窗。安置好参考电极、接地电极。记录电极接人记录放大系统。操纵电极下至目标脑区后，寻找合适、明确的细胞外放电信号，待BLA、DZ及各项生理指标信号稳定后，记录基础数据20 min并存盘。

1.3.4 伤害性刺激

热刺激：将大鼠尾部8—10 cm放入50 ℃水中，3s后取出尾部，持续观察并作记录。夹尾刺激：使用充分绝缘后的血管钳夹持大鼠尾巴后1/3处，以后肢抽动为适宜强度，5s后撤离刺激，持续观察并记录。电刺激：将刺激电极插入大鼠尾巴后1/3处，给予9 Hz， 200卜μs，5 mA恒流刺激，持续观察并记录。采用排列组合的方法进行刺激顺序均衡，安排给予同一大鼠的不同伤害性刺激。刺顺序有6币种方案：HTE、HET、THE、TEH、E—HT、ETH （H： Thermal stimulus；T：Tailpinch；E：Electrical stimulation）。各大鼠随机按其中一组刺激方案进行实验，每种刺激记录刺激前20 min到刺激后40 min的信号。

1.3.5 信号采集参数设置

记录电极所引导和记录的信号经放大器，进入PowerLab多导生理信号采集与处理系统，由计算机中Chart软件进行采集、存盘，采样频率10 kHZ，各通道参数设置如下：BLA、DZ脑电信号高通10 Hz、低通2 kHz.体湍信号低通10 Hz，心电信号高通10 Hz、低通200 Hz，呼吸肌肌电信号高通0.1 Hz、低通200 Hz，皮肤电导信号量程设为l0μS。

1.3.6 记录位点鉴定

实验结束，断头处死大鼠并取脑，置于4%甲醛溶液内固定后做冠状而切片，观察针道位置与图谱BLA、DZ的位置进行比对，进行记录位点鉴定。

1.4

数据分析

I.4.1 记录信号的分析

记录到的脑内核团放电活动信号、各项生理指标信号，分别使用Charl Pro系统软件进行数据测量和分析。分析细胞外记录的核团电活动的放电频率直方图反映核团电活动的频率及其放电活动的特点。幅值为选定时问的每2 s内信号幅度最大值减去最小值的平均值。呼吸肌肌电周期计算，使用Chart Pro软件中周期测量（cyclic mea-suUrements）功能，滤波设为高通150 Hz、最小周期与最小峰高S.D.按数据模拟的准确程度适当调整，将数据添加到数据板，可自动算出均数，即为平均肌电周期或用直接计数法进行统计。

1.4.2 统计学分析

各数据结果均以x±s表示，两组均数差异的比较用t检验，多组均数差异的比较用单因素方差分析，相关性分析用直线相关和直线回归分析。P<0.05为差异有显著性意义。

2

结果

2.1 脑内BLA、DZ电活动和多项生理指标同步记录

典的痛情绪、痛感觉反应代表核团BLA、DZ放电信号和心电、体温、呼吸肌肌电、皮肤电导等各项生理指标稳定记录例示于图1。各信号均稳定的13只大鼠前20 min正常六通道记录数据数据分析显示.其BLA和DZ核团相关性r=0.646，P=0.017，表明两核团放电频率呈正相关。基础记录20 min的BLA脑电幅值（295.26+78.50）μV、DZ脑电幅值（143.61±52.65）μV、体温（37.11±0.67）℃、皮肤电导（0.20+0.18）μS、心率（361.28±24.71） bpm、R波幅度（422.80±145.27）μV、呼吸肌电幅值（81.04±31.52） μV、呼吸肌电平均周期（0.91+0.05）s，与前期报道文章相似。

2.2

热刺激诱发的反应

2.2.1 热刺激对BLA、DZ电活动的影响

对17只给予热刺激实验的大鼠进行BLA、DZ放电频率直方图分析，结果显示其中有10只大鼠在刺激后有BLA、DZ放电频率增高反应，典型结果例示于图2，其余大鼠未诱发出此类现象，对此10只大鼠的热刺激前2 min、热刺激引起的峰反应时、峰反应后2min的BLA放电频率进行统计学分析（图2A），可以看到反应时BLA放电频率相对刺激前有显著性增加（P<0.01），反应后相对反应时放电频率恢复（P<0.01）。同样对DZ脑电进行统计学分析，图2B显示反应时DZ放电频率棚对刺激前有显著性增加（P

2.2.2 热刺激对各生理指标的影响

分析此10只大鼠在热刺激前、刺激时、刺激后呼吸肌肌电频率，结果显示刺激时较刺激前人鼠呼吸频率增快（图3A，P0.05）。

2.3 夹尾刺激诱发的反应

2.3.1 夹尾刺激对BLA、DZ电活动的影响

对17只夹尾刺激大鼠进行BLA、DZ放电频率直方图分析，结果显示在夹尾刺激后共有8只大鼠BLA、DZ出现放电频率增高反应，统计学分析结果表明（图4），反应时BLA、DZ放电频率相对刺激前有明显增加（BLA：P

2.3.2 夹尾刺激对各生理指标的影响

分析此8只大鼠在夹尾刺激前、刺激时、刺激后呼吸肌肌电频率，结果显示刺激时较刺激前大鼠呼吸频率增快（图5A，P<0.05），刺激后又恢复到原来水平（P<0.051。8只大鼠的心电分析显示，夹尾刺激诱发大鼠心跳加快（P0.05）。

2.4 电刺激诱发的反应

2.4.1 电刺激对BLA、DZ电活动的影响

对17只大鼠电刺激前2 min和电刺激后2min数据进行放电频率直方图分析，结果显示有15只大鼠核团放电频率刺激后相对刺激前有所增加（图6，BLA：P=0.072， DZ： P<0.05），其余2只大鼠未诱发此类反应。选取15只大鼠在电刺激后2 min的BLA和DZ放电频率作相关性分析，结果显示r=0.348， P=0.204，说明相关性没有统计学意义，较基础值相关性有所降低。

2.4.2 电刺激对各生理指标的影响

分析此15只大鼠在电刺激前、后呼吸肌肌电频率，结果显示呼吸频率几乎没变化（图7A，，P=0.712）。心电分析（图7B）显示，刺激后大鼠心跳加快（P<0.01），之后未恢复到刺激前状态（反应时、反应后：P>0.05；反应前、反应后：P<0.05），体温和皮肤电导分析后亦兀明显变化（P>0.05）。

2.5 不同伤害性刺激影响脑内BLA、DZ电活动的比较

2.5.1 影响BLA电活动的比较

计算8只大鼠BLA放电频率在不同伤害性刺激下反应时相对于刺激前的变化率，将各种刺激引起变化率的差异进行单因素方差分析。结果显示3种伤害性刺激引起BLA放电频率的改变有差异（表1，One -way ANOVA，F=4.814，P<0.05），两两比较结果显示.8只大鼠热刺激BLA放电变化率高于夹尾刺激的变化率（P=0.02）和电刺激的变化率（P=0.01），说明50 ℃热刺激比夹尾刺激、电刺激更易诱发明显的BLA放电频率的变化，而夹尾刺激和电刺激之间BLA放电频率变化没有显著性差异（P=0.763）。

2.5.2 影响DZ电活动的比较

计算8只大鼠DZ放电频率在不同伤害性刺激下反应时相对于刺激前的变化率，将各种刺激的变化率的差异进行单因素方差分析。结果显示3种伤害性刺激引起DZ放电频率亦有差异（表l，One-way ANOVA，F=5.740，P<0.05）。两两比较结果显示，8只大鼠热刺激引起的DZ放电频率变化率高于夹尾刺激诱发的变化率（P=0.028）和电刺激的变化率（P=0.004），由此说明热刺激比夹尾刺激、电刺激更易诱发明显的DZ放电频率的变化。同样，夹尾刺激和电刺激之间DZ放电频率变化也没有显著性的差异（P=O.361）。

3 讨论

本实验在大鼠进行脑内双核团细胞外记录和多导生理指标同步记录基础上，选择了热刺激、夹尾刺激、电刺激作为诱发疼痛的手段.脑内记录区域选择了与疼痛过程中密切相关的痛情绪代表核团BLA和痛感觉代表区域DZ，在同步记录大鼠在痛觉过程中脑内BLA和DZ放电活动的变化的同时，观察反映情绪的生理指标。结果显示不同伤害性刺激均可在三方面记录指标上产生显著性影响。表明本实验技术不仅能够检测在伤害性刺激的作用下中枢神经系统的痛感觉代表区域和痛情绪的代表核团的放电频率，还能将反映情绪的外周生理指标一并分析，形成了一个综合的痛觉记录系统，是一种可行的心理生理学研究的技术。

本实验所用的伤害性刺激方案参照各类文献的做法，每种伤害性刺激为引起大鼠发生痛反应的阈值刺激，从而使得伤害性刺激之问具有可比性。对不同伤害性刺激下的中枢脑电发放情况进行了一系列分析。结果表明，大鼠在接受热刺激和夹尾刺激后痛感觉代表区域DZ和痛情绪代表核团BLA脑电活动都较反应前有大幅度的增加，一段时问后又恢复到之前的水平。而电刺激后，痛感觉的代表区域DZ脑电频率反应时较反应前有明显增加；而代表痛情绪的脑部核团BLA脑电频率增加无统计学差异。由此可以看出，电刺激诱发的BLA放电没有热刺激和夹尾刺激强，推测可能是处理情绪的中楸对热刺激和机械性刺激（夹尾）更加的敏感，更易产生反应。为深入探讨不同种伤害性刺激之问所诱发的中枢神经系统电活动的差异，本实验采用的单因素方差分析（One-way ANOVA）结果发现，热刺激、夹尾刺激、电刺激之问的痛感觉和痛情绪反应是具有显著性差异的，说明中枢神经系统对疼痛处理过程是不相同的。由此，本文所采用的实验方法可以很好地鉴别出不同种伤害性刺激，即说明不同种伤害性刺激所诱发的痛感觉和痛情绪的中枢代表区域的电活动是有差异的。各种刺激后脑内BLA、DZ核团电活动的相关性都有所改变，表明各种伤害性刺激后使得痛感觉、痛情绪反应代表核团之问的相互关系发生了一定的改变，尤其是央尾刺激后两核团之间的相关性，南此提示夹尾伤害性刺激后，可能导致痛感觉和痛情绪之问的联系程度更加紧密，但是具体发生的机制需进一步的研究。

本实验在检测到中枢神经系统反应时，同时检测的外周生理指标能够反映大鼠情绪的变化，从而可以探讨外周情绪指标与反映中枢神经系统的痛情绪指标BLA脑电活动之间的关系。有趣的是在不同种伤害性刺激后，大鼠的心率都发生了很大程度的变化，呼吸肌肌电频率在热刺激和夹尾刺激都发生了相似性的反应，电刺激并未诱发出呼吸肌肌电频率的变化。单因素方差分析得到的结果有力证明了不同伤害性刺激所诱发的BLA放电活动是不相同的，但从3组实验来看，除了电刺激时呼吸肌肌电变化不明显，外周反映情绪的其他指标都有相似的变化。同时，电刺激过程中BLA放电活动没有发生显著性变化，呼吸肌肌电频率也没有显著性变化，推测代表中枢神经系统痛情绪指标（BLA电活动）与呼吸肌肌电有密切的联系，而是否与心率的关系也密切，仍需进一步的实验研究。体温、皮肤电导在本实验过程中并未表现出很明显的变化，究其原因可能在给予大鼠麻醉后，相关神经中枢或调节机制受抑，故对外界的伤害性刺激未做出特征性反应。