尘螨变应原Der f 9、Der p 9和Blo t 9结构与功能的比较研究

滕飞翔 孙金霞 俞黎黎 卞勇华 王运刚 王 楠 张承伯 崔玉宝

摘 要：使用多种生物信息学工具来预测、比较尘螨变应原Der f 9、Der p）9和Blo t 9的一级、二级、三级结构及抗原表位，找出3种蛋白结构及功能的异同Der f 9、Der p 9和Blo t 9氨基酸序列一致性为82.07%，都含有3个胰蛋白酶活性位点氨基酸及2个功能结构区特异性序列；二级和三级结构中都由α一螺旋、β折叠和无规卷曲组成：活性位点氧基酸在三级结构中完全重合，并相互靠近构成蛋白酶的活性中心；主要潜在抗原表位区域都为5个，并在第47-49aa和200-203aa区域出现了重合.但表位重合区的氨基酸种类不完全相同 ，应用生物信息方法预测和比较了Der f 9、Der p 9和Blo t 9结构与抗原方面的信息.为进一步研究变应原第9组分的生物学功能、疫苗研制奠定了基础。

关键词：尘螨：变应原；结构；抗原表位

中图分类号：Q71

文献标识码：A

文章编号：1007 7847（2014）06一0483一05

尘螨（house dust mites）广泛存在于人类生活和工作环境中，是室内变应原的重要来源之一，其螨体、螨卵、螨蜕下的皮、死亡螨体的裂解物及活螨的排泄物、分泌物等都可成为变应原，可导致多种I型变心性疾病，如变成性哮喘、变应性鼻炎、变应性皮炎等。 目前发现粉尘螨（Der-matophagoides farinae. Der f）、屋尘螨（Dermato -phayoides pteronyssinus， Der p）和梅氏嗜霉螨（Eu-roglyphus maynei，Eur m）是3种世界范围内广泛分布的室内优势致敏螨类。在热带和亚热带地区.热带无爪螨（Blomia tropicalis，Blo t）也是重要的室内优势致敏螨种。目前发现的尘螨变应原组分共有24种，其中变应原第9组分具有胰蛋白酶活性，属于胰蛋白酶家族，与IgE结合率很高.达到90%。

本文拟通过生物信息学方法.将同属胰蛋白酶家族Der f 9、Der p 9和Blo t 9的理化性质、一级结构、二级结构、三级结构和B细胞抗原表位等指标进行比较.找出这3种蛋白结构与功能之间的异同，为后续进行克隆表达、生物学功能及免疫学特性研究提供依据，从而为其在变态应性疾病诊断、药物及疫苗研究中的应用研究提供线索。

1 材料与方法

1.1

Der f 9、Der p 9和Blo t 9氨基酸序列的获取

从国际免疫学会联合会（the international u-nion of immunological societies，IUIS）下属的变应原命名委员会命名数据库（IUIS allergen nomen-clature sub -committee， nomenclature database）和NCBI中的Protein数据库获得变应原Der f9、Der p9和Blo f 9氨基酸序列，去除信号肽序列后，将成熟肽氨基酸序列以FasLa格式保存进行后续操作。

1.2

Der f 9、Der p 9和Blo t 9的理化性质与一级结构分析

使用Expert protein analvsis system （ExPASy）Proteomics toolS所提供的ProtParam软件分别进行氨基酸残基数目、组成、蛋白质分子质量和亲/疏水性等理化性质的在线分析。使用DNAMAN6.0对3种变应原氨基酸序列进行比对。使用ExPASv中的PROSITE有预测功能域特征序列和活性位点。

1.3

Der f 9、Der p 9和Blo t 9的二级结构分析

使用TMHMM服务器预测3种蛋白的跨膜区域。使用Jpred服务器在线分析3种蛋白的α-螺旋、β-折叠及无规则卷曲组成情况。

1.4

Der f9、Derp9和Blot9的三级结构同源建模

使用同源建模方法来构建3种蛋白的三级模型：将3种蛋白的氨基酸序列分别输入BLASTP服务器，选取高一致性（高于30%）、低e-value和Gaps值的蛋白质作为3种蛋白的最适合模板，最终确定PDB数据库中登录号为4D8N、1L2E和1EQ9的蛋白质分别作为Derf 9、Der p 9和Blo t 9同源建模的模板。将3种蛋白质和模板分别输入到Modeller 9.12软件中，进行目的蛋白三级模型的构建。使用Swiss-PdbViewer对构建出来的三级模型进行能量最小化处理，并使用Procheck和Verify_3D三级程序（http：//nihserver.mbi.ucla.edu/SAVS/）对蛋白质三级模型进行评估。使用Chimera l.8软件展示、重合蛋白质的三级模型。

1.5 Der f 9、Der p 9和Blo t 9抗原表位分析

使用IEDB analysis resource .ABCpred 和Bepi-Pred软件，同时结合二级结构和三级结构分析预测3个氨基酸序列的线性B细胞抗原表位，并将预测出来的主要表位标注到蛋白质序列比对结果及三级模型中。

2 结果

2.1 Der f 9、Der p 9和Blo t 9蛋白质理化性质比较分析

螨变应原第9组分的生化名称是胶原溶解丝氨酸蛋白酶，属于胰蛋白酶蛋白质家族：Der 9、Der p 9和Blo t 9的氨基酸残基总数都是224；而原子总数和相对分子质量等指标，Der f 9和Derp9之间比较接近。Der f 9、Der p 9和Blo t 9的碱性氨基酸数目分别是13、11和12个，而三者的酸性氨基酸数目相差不大，分别为17、17和16个。等电点（pl）的数值表明，三者都是碱性蛋白质。3种蛋白脂肪指数都很大，表明脂溶性很强；不稳定指数都低于阈值40，都为稳定性蛋白：主要平均疏水特性（GRAVY）低于0，都为亲水性蛋白：

2.2 Der f 9、Der p 9和Blo t 9-级结构、功能结构域比较

Der f 9、Der p 9和Blo t 9氨基酸序列一致性为82.07%，都含有3个活性位点氨基酸，分别为组氨酸（His）、天冬氨酸（Asp）和丝氨酸/半胱氨酸（Ser/Cys）（表2）。虽然3个活性位点氨基酸在一级结构上相距甚远，但在三级结构中却相互靠近，构成酶的活性中心（图4）。Der f 9.Der p 9和Blot9在活性位点氨基酸His和Ser/Cvs周围形成了胰蛋白酶功能结构区特异性序列，分别是LTAAHC与XXCNGDS（或C）GGPLX（见图1中第I、Ⅱ区域）。

2.3

Der f 9、Der p 9和Blo t 9二级结构比较分析

Der f 9、Der p 9和Blo t 9都没有跨膜区域，全位于胞外；同时三者的二级结构都含有α-螺旋、β-折叠和无规卷曲结构（图2），并且都是无规卷曲的比例最高，β-折叠的比例其次，α-螺旋所占比例最低（表3）。三者的α -螺旋和β一折叠比例比较的结果显示.Der f 9的α-螺旋比例最高，Der p 9的α-螺旋比例最低；Der p 9的β-折叠比例要高于Der f 9和Blo t 9（表3）。

2.4 Der f 9、Der p 9和Blo t 9的三级结构比较分析

将预测出的Der f 9、Der p 9和Blo t 9蛋白的三级结构进行评测。Der f 9、Der p 9和Blo t 9蛋门质分别有100%、99.5%和98.9%，氨基酸残基位于Ramachandran plot检测图中的合理区域（图3），这说明模建结构的氨基酸二而角是非常合理的。verify_3D评分结果显示，Der f 9、Der p 9和Blot 9分别有89.78%、92.89%和96.56%，氨基酸残基三级-1D的相容性分值大于0.2，这表明三个模型一级序列与三级结构的相容性较好。以上评估结果均表明，同源模建所得到的Der f 9、Der p9和Blo t 9的二级结构是合理可信的。

Der f 9、Derp 9和Blo t 9 三级结构中，也是无规卷曲的比例最高，β-折叠的比例其次，α -螺旋所占比例最低（图4）。三级结构中.Der f 9 、Der p9和Blo t 9的α-螺旋比例分别是12.17%（3个区段）、10.27%（3个区段）和10.71%（4个区段）：β一折叠比例分别是30.80%（12个区段）、31.25%（12个区段）和28.57%（12个区段）。三级结构重合的结果显示.三者在α -螺旋和β-折叠处发生了程度较高的重合：在部分无规卷曲区域，三者重合程度稍差：三者的活性位点氨基酸则完全重合，并相互靠近构成酶活性中心（图41。

2.5

Der f 9、Der p 9和Blo t 9的B细胞抗原表位比较分析

抗原表位预测结果显示，Der f 9、Der p 9和Blo t 9氨基酸序列中都有5个主要潜在抗原表位（表4），都位于蛋白质的无规卷曲区域（图4）。另外三者的抗原表位在两个区域（图1的A和B区域）出现了重合.但氨基酸种类并不完全一致。A区域（第47-49位氨基酸）中，Der f 9的抗原表位为EAS. Der p 9抗原表位为EAT，Blo t 9抗原表位为ENN；B区域（第200-203位氨基酸）中，Der f 9的抗原表位为CLSN. Der p 9抗原表位为CLST，Blo t 9抗原表位为CLHA。

3 讨论

目前常用于治疗变应性哮喘、鼻炎等I类变态反应性疾病的药物，一般与发病机制中的组胺、肥大细胞和Ig E抗体3个环节相关，但治疗效果都不太理想，且副作用也较大。随着医学的发展，特异性免疫疗法（speCific immunotherapy，SIT）逐渐被用来治疗I型变反应性疾病，此疗法具有疗效持久、阻滞症状的恶化和防止对新变应原产生过敏等优点，被认为是I类变应性疾病唯一病因疗法。

螨类变应原是引起I型变态反应性疾病的重要变应原之一，此类疾病SIT疗法常用的变应性疫苗是尘螨粗提浸液，但该浸液存在变应原、非过敏性或毒性蛋白及其他成分，容易产生副反应，并且很难进行标准化，无法明确患者对变应原各组分的反应程度。近年来，使用基因重组变应原方法诊断和治疗I型变态反应性疾病逐渐成为主流。在基因重组螨变应原表达过程中，呵减弱其与Ig E抗体的结合能力，保留其与T细胞结合位点，因而具有较好的免疫原性，减少免疫治疗的危险性，提高脱敏治疗的效果，可替代传统的天然变应原浸液。

Der f 9、Der p 9和Blo t 9都属于胰蛋白酶家族成员，氨基酸序列一致性为82.07%。三者既是碱性蛋白质，又是脂溶性、稳定性都很强的亲水性蛋白，都含有3个活性位点氨基酸，分别是His、Asp和Ser/Cvs、His、Asp和Ser/Cvs都是构成蛋白酶活性中心的常见氨基酸种类，尽管3种蛋白的His、Asp和Ser/CVs氨基酸在一级结构上相距甚远，但在它们在三级结构中却完美重合在一起，前相互靠近，从而构成酶的活性中心（图4D）。此外，3种蛋白都His和Ser/Cys周围形成了胰蛋白酶功能结构区特异性序列，即LTAHC与XXCNGDS（或C）GGPLX。

Der f 9、Der p 9和Blo t 9二级结构和三级结构都含有α一螺旋、β-折叠和无规卷曲 3种结构，并且都是无规卷}的比例最高，α-螺旋所占比例最低蛋白质的二级结构和三级结构足预测抗原表位的重要信息，α-螺旋、β-折叠等结构的化学键键能比较高，不易形成抗原表位序列，而无规卷曲结构则常突出在蛋白的表而，从而构成蛋白质的功能区，该区域内常含有B细胞的优势抗原表位。Der f 9、Der p 9和Blo t 9主要潜在抗原表位都为5种，全部位于蛋白质的尤规卷曲区域；另外三者的表位出现了2个重合区域，但重合的氨基酸种类并不完全相同。

本研究初步找出了Der f 9、Der p 9和Blo t 9结构与功能之间的异同，为本课题后续进行实验确定蛋白质三级结构和筛选抗原表位，进而研制尘螨变应原第9组分的诊治疫苗和药物奠定了基础。另外本研究还找出了尘螨变应原笫9组分的活性位点氨基酸和特异性胰蛋白酶功能域，为以后寻找和归类新变应原提供了一定的理论基础。