巴西橡胶树HbCZF1的原核表达分析

易红艳等

摘 要 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGR）是天然橡胶生物合成途径中的关键酶之一，在先前的研究中本课题组已克隆了与Hmgr1启动子互作的转录因子基因HbCZF1。本研究在此基础上，构建了HbCZF1的原核表达载体PET-28a（+）-HbCZF1，将其转化E. coli Rosetta（DE3）菌株。经优化条件后，在20 ℃，0.1 mmol/L IPTG诱导4 h的条件下，获得了分子量约47 ku的HbCZF1融合蛋白。

关键词 巴西橡胶树；HbCZF1基因；原核表达；蛋白纯化

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

Abstract The enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase（HMGR）is involved in the biosynthesis of rubber. We cloned HbCZF1 which is interaction with the HbHMGR promoter in Hevea brasilensis. In order to study the function of HbCZF1， an HbCZF1 prokaryotic expression vector was successfully constructed. The pET-28a（+）-HbCZF1 construction was transferred into E. coli Rosetta（DE3）. Recombinant protein was expressed in abundance in E. coli Rosetta（DE3）after being induced by 0.1 mmol/L IPTG for 4 hours at 20 ℃. The molecular mass of the recombinant protein is about 47 ku. The result laid a foundation for the further preparation of the HbCZF1 transcription factor antibodies and the analysis of interactions between the HbCZF1 and the HbHMGR promoter.

Key words Hevea brasiliensis； HbCZF1； Prokaryotic expression； Protein purification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.014

锌指蛋白是真核生物基因组中广泛存在的一类转录因子，在基因的表达调控、细胞分化、胚胎发育、成熟等生命过程中发挥重要作用[1-3]。在锌指蛋白家族中，CCCH型锌指蛋白仅占所有锌指蛋白的约0.8%[4-5]。目前的研究结果表明：CCCH型锌指蛋白在植物中的主要作用是调节植物生长发育以及生物和非生物的胁迫反应[6-10]，如Sun等[11]发现拟南芥AtSZF1和AtSZF2可负调控盐胁迫相关基因的表达，Kong等[12]发现在水稻中过量表达CCCH型锌指蛋白基因OsDOS可以延缓水稻叶片的衰老等。

巴西橡胶树是一种重要的热带产胶植物，是天然橡胶主要的商业来源，在世界经济发展中一直占有重要的地位。天然橡胶在橡胶树的乳管内合成，以胶乳（乳管细胞的细胞质）的形式贮存[13]。橡胶生物合成是一种典型的植物甲羟戊酸（Mevalonate，MVA）代谢途径[13]。3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGR）在MVA代谢途径中不可逆地催化HMG-CoA形成甲羟戊酸，继而合成橡胶前体物质，是MVA途径的第1个限制酶， 也是天然橡胶生物合成途径中的关键酶之一[13-20]。橡胶树HMGR是由3个基因Hmgr1、Hmgr2和Hmgr3组成的基因家族编码的。根据3个基因在组织中的表达特性，Chye等[21-22]认为Hmgr1可能与橡胶生物合成有关。张福城等[23]克隆了Hmgr1基因的启动子，并对顺式作用元件进行了分析。刘陈[24]利用酵母单杂交筛选到调控Hmgr1的CCCH型锌指蛋白类的转录因子HbCZF1，但Hmgr1与转录因子HbCZF1之间的调控关系还不清楚。为了进一步研究Hmgr1与转录因子HbCZF1之间调控关系，本研究构建了HbCZF1原核表达载体并进行原核表达，获得了HbCZF1的融合蛋白，为下一步制备抗体、凝胶迁移（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）等深入研究Hmgr1与转录因子HbCZF1之间的调控关系打下了基础。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

含有HbCZF1基因的质粒、原核表达载体pET-28a（+）、E. coli DH10B 菌株、E. coli Rosetta （DE3）菌株由本实验室保存；Adevantage 2 PCR Kit 为Clontech公司的产品；pMD19-T Simple Vector试剂盒、T4 DNA连接酶为TaKaRa公司的产品；普通质粒小提试剂盒、DNA marker、过硫酸铵、异丙基-β，D-硫代半乳糖苷（IPTG）、抗生素等均为中科瑞泰提供；Ni-NTA亲和层析纯化柱购于MACHEREY-NAGEL；各限制性内切酶、Protein marker为Fermentas公司的产品；HIS Tag羊抗兔抗体、二抗及Western-blot试剂盒为博士德公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 根据本实验室现有的HbCZF1基因的ORF序列设计引物6PCZF1F/ 6PCZF1R，并在引物两端加上酶切位点BamHⅠ/XhoⅠ（酶切位点下划线表示），其序列为：6PCZF1F（5′-ACGGATCCATGAATCCATTGACGCTGGT-3′）；6PCZF1R（5′-GACTCGAGTCATCTCTCTGATTTGCG

CC-3′），引物的合成由北京诺赛生物技术公司完成。

1.2.2 pET-28a（+）-HbCZF1重组表达载体的构建

以橡胶树HbCZF1基因的全长质粒为模板进行PCR扩增，反应条件为：首先在95 ℃ 2 min，然后在95 ℃ 30 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min进行30个循环。将扩增得到的目的片段纯化后连接到 pMD19-T Simple Vector上，连接产物转化感受态E. coli DH10B，在含Amp抗性的LB固体培养基上培养，挑取单菌落进行菌液PCR后，选取阳性克隆测序，并对测序正确的阳性克隆提取质粒进行BamHⅠ/XhoⅠ的双酶切鉴定。将线性pET28a（+）载体片段和目的基因片段用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物转化感受态E. coli DH10B，筛选阳性克隆测序。选取测序正确的阳性克隆，提取质粒用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定。

1.2.3 HbCZF1基因的原核表达及表达条件的优化

将重组表达载体pET-28a（+）-HbCZF1和pET-28a（+）的空载体分别转化E. coli Rosetta（DE3）菌株，挑取单菌落接种于5 mL Kan（100 mg/mL）抗性的LB液体培养基中，37 ℃，200 r/min振荡培养过夜，按1 ∶ 100的比例吸取菌液接种于20 mL Kan（100 mg/mL）抗性的LB液体培养基中，37 ℃，200 r/min振荡培养至OD600=0.5～0.8后，以1 mmol/L IPTG诱导4 h，取样进行SDS-PAGE来观察重组蛋白是否表达。然后分别以不同浓度的诱导剂IPTG（终浓度为0.1、0.3、0.5、1 mmol/L）和不同的诱导时间（1、2、3、4 h）进行诱导，将所取的样品进行 SDS-PAGE分析。确定最佳的诱导时间和 IPTG浓度后，在20 ℃和37 ℃条件下分别进行诱导。在诱导结束后，4 ℃条件下离心收集菌体，每100 mL培养物的细胞沉淀重悬于4 mL含蛋白酶抑制剂PMSF的结合缓冲液（pH=7.8，20 mmol/L磷酸钠，500 mmol/L NaCl）中，用超声波破碎仪破碎菌体，离心后分别取上清和沉淀样品进行SDS-PAGE分析，以确定最佳的诱导条件。

1.2.4 重组蛋白的纯化及鉴定 收集菌体，每100 mL培养物的细胞沉淀重悬于4 mL含有蛋白酶抑制剂PMSF的结合缓冲液（pH=7.8）中，超声波破碎至菌液澄清，离心后收集上清，将收集的上清过Ni-NTA层析柱并洗脱下来，即可得到纯化的重组蛋白。该蛋白经SDS-PAGE电泳、转膜后，用羊抗兔HIS标签的抗体进行Western-blot鉴定。

2 结果与分析

2.1 HbCZF1原核表达载体的构建

根据本实验设计的引物，以HbCZF1基因的全长质粒为模板，通过PCR进行扩增到1条特异性条带（图1），测序结果表明，该条带大小为1 110 bp，且其序列与已知序列一致，并无错配碱基的出现。

将纯化的目的条带克隆到pMD19-T Simple载体上，选取测序正确的阳性克隆的质粒，对其进行双酶切鉴定，并将其命名为pMD19-T-HbCZF1。质粒pMD19-T-HbCZF1经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后，凝胶电泳分析可见2 500 bp左右大小的载体片段条带与1 110 bp左右大小的目的片段（图2）， 表明目的片段成功克隆到pMD19-T Simple载体上。

pMD19-T-HbCZF1重组质粒经BamHⅠ和XhoⅠ酶切后回收HbCZF1基因片段，与同样经过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切的pET-28a（+）连接，转化筛选后得到重组质粒，并将其命名为pET-28a（+）-HbCZF1。同时，选取重组质粒的阳性克隆送去测序，测序结果与对应序列一致。用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ对测序正确的重组表达质粒pET-28a（+）-HbCZF1进行双酶切鉴定。重组质粒经双酶切后可见约5 400 bp大小的载体片段与1 110 bp大小的目的基因片段（图3），表明目的基因片段已经插入到pET-28a（+）表达载体中。

2.2 重组蛋白表达条件的优化

在37 ℃下，以1 mmol/L IPTG诱导4 h后，SDS-PAGE电泳结果表明：pET-28a（+）-HbCZF1样品中有分子量47 ku左右的特异表达蛋白条带，而pET-28a（+）的样品则没有（图4-A），这与预测结果一致。在37 ℃下，以不同浓度的IPTG诱导4 h后，均有目的重组蛋白表达，几个测试的IPTG浓度对表达的蛋白量影响无明显差异（图4-B），因此选取IPTG浓度为0.1 mmol/L进行下一步的研究。在37 ℃和IPTG浓度为0.1 mmol/L条件下，随着诱导时间的增加，重组蛋白的表达量随之增加（图4-C）。诱导结束，超声波破碎菌体处理后，沉淀中含有重组蛋白，上清中亦有不少重组蛋白的存在。这说明该重组蛋白有可溶性的表达。在相同诱导时间（4 h）内，0.1 mmol/L的IPTG诱导时上清中含有的重组蛋白最多（图4-D）。因此，初步确定终浓度0.1 mmol/L的IPTG诱导4 h是重组蛋白适合的表达条件。

在确定了的最适IPTG浓度和表达时间条件下，对诱导的温度进行比较。电泳结果表明：20 ℃和37 ℃的诱导条件下都有大量目的蛋白表达（图5）。经超声波破碎处理，诱导下20 ℃目的蛋白上清中的蛋白含量相较于37 ℃有微量的增加，但并不显著（图5）。即与37 ℃诱导条件相比，温度降低后可溶性蛋白含量并没有明显增加，故用 20 ℃或37 ℃诱导均可。

2.3 重组蛋白的纯化及鉴定

20 ℃，0.1 mmol/L IPTG诱导后，用Ni-NTA柱纯化蛋白后SDS-PAGE检测发现：纯化所得的蛋白分子量亦约为47 ku（图6-A），这与未纯化的融合蛋白大小一致，可推测该纯化的蛋白即为目的蛋白。Western-blot的检测结果表明：该纯化的蛋白带有HIS标签（图6-B），即可知纯化得到的目的蛋白就是HbCZF1蛋白，可用作抗原制备多克隆抗体或进行EMSA。

3 讨论

目前对橡胶树中HMGR的表达调控机制还不了解，为了深入研究HMGR的表达调控的分子机制，本研究室利用酵母单杂技术筛选调控HMGR的转录因子，并已获得与Hmgr1启动子互作的CCCH型转录因子HbCZF1。HbCZF1是橡胶树中首个被发现的CCCH型锌指蛋白，为了进一步研究HbCZF1的功能及其与Hmgr1启动子的调控关系，笔者对HbCZF1进行了原核表达分析。

原核表达系统是目前掌握最为成熟的一种表达系统，通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白，其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，且所需的成本相对比较低廉[25]。但同时原核表达系统还存在如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难等缺点[26]。因此选择原核表达系统必须对表达条件进行优化。在对HbCZF1进行原核表达时，曾构建了4种重组表达载体pET-28a（+）-HbCZF1、pGEX6P-1-HbCZF1分别转入表达宿主菌E. coli Rosetta（DE3）中。结果发现pGEX6P-1-HbCZF1没有获得表达，究其原因还需探讨。在优化pET-28a（+）-HbCZF1在E. coli Rosetta（DE3）菌株中的表达条件中，采用适当的IPTG浓度及诱导时间、温度，尽量减少了过量表达对细胞的毒害作用，故得到了表达量较高的可溶性融合蛋白，并进一步获得了纯化的目的蛋白。HbCZF1的原核表达的研究为下一步制作单克隆抗体，利用EMSA等进一步研究转录因子HbCZF1的功能奠定了基础。

参考文献

[1] 秦智慧， 杨青川. CCCH型锌指蛋白研究进展[J]. 生物技术通报， 2010（8）： 1-6.

[2] 王晓霞. CCCH型锌指蛋白的研究进展[J]. 武汉生物工程学院学报， 2007， 3（3）： 171-175.

[3] Chai G， Hu R， Zhang D， et al. Comprehensive analysis of CCCH zinc finger family in poplar（Populus trichocarpa）[J]. BMC Genomics， 2012， 13： 253.

[4] Brown R S. Zinc finger proteins： getting a grip on RNA[J]. Curr Opin Struct Biol， 2005， 15： 94-98.

[5] Hall T M. Multiple modes of RNA recognition by zinc finger proteins[J]. Curr Opin Struct Biol， 2005， 15： 367-373.

[6] Takatsuji H. Zinc-finger transcription factors in plants[J]. Cell Mol Life Sci， 1998， 54： 582-596.

[7] 郗冬梅， 朱东方. 植物CCCH型锌指蛋白研究进展[J]. 山东农业科学， 2012， 44（5）： 20-22.

[8] Kim D H， Yamaguchi S， Lim S， et al. SOMNUS， a CCCH-type zinc finger protein in Arabidopsis， negatively regulates light-dependent seed germination downstream of PIL5[J]. Plant Cell， 2008， 20（5）： 1 260-1 277.

[9] Guo Y H， Yu Y P， Wang D， et al. GhZFP1， a novel CCCH-type zinc finger protein from cotton， enhances salt stress tolerance and fungal disease resistance in transgenic tobacco by interacting with GZIRD21A and GZIPR5[J]. New Phytol， 2009， 183（1）： 62-75.

[10] Pomeranz M， Finer J， Jang J C. Putative molecular mechanisms underlying tandem CCCH zinc finger protein mediated plant growth， stress， and gene expression responses[J]. Plant Signal Behav， 2011. 6（5）： 647-651.

[11] Sun J Q， Jiang H L， Xu Y X， et al. The CCCH-type zinc finger proteins AtSZF1 and AtSZF2 regulate salt stress responses in Arabidopsis[J]. Plant Cell Physiol， 2007， 48（8）： 1 148-1 158.

[12] Kong Z， Li M， Yang W， et al. A novel nuclear-localized CCCH-type zinc finger protein， OsDOS， is involved in delaying leaf senescence in rice[J]. Plant Physiol， 2006， 141（4）： 1 376-1 388.

[13] Kush A. Isoprenoid biosynthesis： the Hevea factory[J]. Plant Physiol Biochem， 1994， 32： 761-767.

[14] 段翠芳， 曾日中， 黎 瑜. 激素对巴西橡胶树橡胶生物合成的调控[J]. 热带农业科学， 2004， 24（5）： 61-68.

[15] Wititsuwannakul R， Wititsuwannakul D， Suwanmanee P. 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase from the latex of Hevea brasiliensis[J]. Phytochem， 1990， 29（4）： 1 401-1 403.

[16] 张福城， 陈守才. 巴西橡胶树天然橡胶生物合成中关键酶及相关基因研究进展[J] .热带农业科学， 2006， 26（1）： 42-46.

[17] Schaller H， Grausem B， Benveniste P， et al. Expression of the Hevea brasiliensis（H.B.K.）Mull. Arg. 3-hy-droxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase 1 in tobacco results in sterol overproduction[J]. Plant Physiol， 1995， 109（3）： 761-770.

[18] 于俊红， 黄绵佳， 田维敏. 巴西橡胶树橡胶生物合成调控的研究进展[J]. 安徽农学通报， 2007， 13（12）： 38-40.

[19] 邹 智， 杨礼富， 王真辉， 等. 橡胶树中橡胶的生物合成与调控[J]. 植物生理学通讯， 2009（12）： 1 231-1 237.

[20] Wititsuwaannakul D， Rattanapittayaporn A， Koyama T， et al. Involvement of Hevea latex organelle membrane proteins in the rubber biosynthesis activity and regulatory function[J]. Macromol Biosci， 2004， 4（3）： 314-323.

[21] Chye M L， Kush A， Tan C T， et al. Characterization of cDNA and genomic clones encoding 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase from Hevea brasiliensis[J]. Plant Mol Biol， 1991， 16： 567-577.

[22] Chye M L， Tan C T， Chua N H. Three genes encode 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase in Hevea brasiliensis： hmg1 and hmg3 are differentially expressed[J]. Plant Mol Biol， 1992， 19： 473-484.

[23] 张福城， 邓 治， 张云霞， 等. 天然橡胶合成关键酶基因Hmg1启动子克隆与序列分析[J]. 热带作物学报， 2006， 27（3）： 40-45.

[24] 刘 陈. 调控橡胶树Hmg1的转录因子的克隆及表达分析[D]. 海南大学， 2012.

[25] 郭广君， 吕素芳， 王荣富. 外源基因表达系统的研究进展[J]. 科学技术与工程， 2006（5）： 1 671-1 815.

[26] 孙柏欣， 刘长远， 陈 彦， 等. 基因表达系统研究进展[J]. 现代农业科技， 2008（2）： 205-209.