基于ITS2条形码的南药巴戟天真伪鉴别

黄琼林等

摘 要 本研究旨在建立基于ITS2条形码的巴戟天及其混伪品的真伪鉴别方法。采用试剂盒提取巴戟天植物样品的总DNA，以一对通用引物对其ITS2条形码进行PCR扩增并测序；从Genbank数据库获取巴戟天及其混伪品ITS2序列。采用DNAMAN、ClustalX软件拼接比对序列，以及利用MEGA5.1软件构建NJ树。获得的22条ITS2序列的长度范围为224～244 bp，GC含量范围为59.8%～70.1%。巴戟天与8种混伪品的ITS2序列存在155处变异，种间K2P遗传距离远大于种内K2P遗传距离。基于ITS2条形码的NJ聚类树能直观地区分巴戟天及其混伪品。因此，ITS2条形码适用于南药巴戟天及其混伪品的鉴别，可为其基原研究提供重要的分子鉴定证据。

关键词 巴戟天；混伪品；ITS2条形码；鉴别

中图分类号 S567.239 文献识别码 A

Identifying Morinda officinalis and Its Adulterants

Based on ITS2 Barcode

HUANG Qionglin1， ZHENG Xiasheng2， CAI Chun1*

1 Guangdong Medical College， Zhanjiang， Guangdong 542023， China

2 Guangzhou University of Chinese medicine， Guangzhou， Guangdong 510006， China

Abstract The study aimed to establish a novel identification method for Morinda officinalis and its adulterants based on ITS2 barcode. Genomic DNA was extracted from M. officinalis leaves kept in gel and ITS2 region was amplified and sequenced with a pair of universal primers. ITS2 sequences of M. officinalis and its adulterants acquired from plant materials and Genbank were assembled and aligned by DNAMAN and CLUSTALX， and the NJ tree was constructed using MEGA 5.1. Significant differences were observed in the ITS2 sequences between M. officinalis and its adulterants. The interspecific genetic distance was far more than the intraspecific distance. NJ tree based on ITS2 sequences can distinguish M. officinalis and its adulterants intuitively. Therefore， ITS2 barcode could be used to identify M. officinalis and its adulterants effectively， and provide important molecular evidence for the authentication of germplasm resources.

Key words Morinda officinalis； Adulterants； ITS2 barcode； Identification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.021

巴戟天是中国著名“四大南药”之一，药典收载正品来源于茜草科巴戟天属植物巴戟天（Morinda officialis How.）的干燥肉质根，味辛甘、性温，具有补肾助阳，祛风除湿，强筋健骨的功效，主治肾虚阳萎、遗精早泄、少腹冷痛、小便不禁、宫冷不孕、风寒湿痹、腰膝酸软等症[1]。由于药食两用的价值，巴戟天在民间和商业上均被广泛利用和开发，但人工栽培无法满足当前的需求。市售巴戟天药材频频出现伪品，如同属的假巴戟Morinda shuanghuaensis、鸡眼藤Morinda parvifolia、羊角藤Morinda parvifolia等，这些物种的形态与巴戟天极为相似，仅靠传统鉴定技术无法完全将其区别。这些混伪品的成分与巴戟天存在较大差异，功效不尽相同，它们的存在对巴戟天的临床用药造成很大的安全隐患，也制约了巴戟天产业现代化的进程。

由于传统方法对巴戟天真伪鉴别存在不足，前人也已采用DNA序列分析进行巴戟天及其伪品的鉴别。丁平等[2]利用ITS序列对巴戟天与3个伪品（假巴戟、羊角藤和虎刺Damnacanthus indicus）进行鉴别，但是ITS序列较长，对DNA质量要求高，PCR扩增和序列分析难度较大。姬生国等[3]分析了巴戟天及樟叶巴戟Morinda cinnamomifoliata等4个伪品的psbA-trnH序列差异，但变异水平低，容易产生误差，在一定程度上不利于更多样品的鉴别。因此，有必要在更广泛样本的基础上建立简便准确的巴戟天真伪鉴别方法。

本文利用当前热门的药用植物DNA条形码——核内第二转录间区（secondary internal transcribed space， ITS2）对巴戟天及其8种混伪品进行鉴别，为其临床用药安全和资源保护提供分子依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本研究所用的ITS2序列来源于植物样品实验或Genbank下载（表1）。植物样品采集于广州中医药大学大学城校区药王山，经广州中医药大学中药鉴定教研室童家赟讲师鉴定，取其叶片置硅胶中保存备用。

植物基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生物科技公司；PCR试剂、Ex Taq DNA聚合酶、DNA Markers购自大连宝生物工程公司；引物合成和测序由北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司完成。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、PCR扩增和测序 巴戟天叶片总DNA采用植物基因组DNA提取试剂盒进行提取。利用ITS2条形码特异性引物（上游：5′-ATGCGAT

ACTTGGTGTGAAT-3′；下游：5′-GACGCTTCTCCA

GACTACAAT-3′）[4]进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为50 μL，其中10×Ex Taq buffer 5 μL、dNTP（10 mmol/L）3.0 μL、正反向引物（10 μmol/L）各1.0 μL、模板DNA 1.0 μL、Ex Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.5 μL，用灭菌蒸馏水补足体积。PCR反应程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 0.5 min，52 ℃ 0.5 min，72 ℃ 1.0 min，33个循环；72 ℃ 7 min。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测，纯化后送样测序。

1.2.2 序列分析 采用DNAMAN软件进行序列拼接，基于隐马尔可夫模型的HMM方法（http：//its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/）获取纯ITS2区序列[5]，并采用Bankit软件向Genbank提交植物样品实验所获序列；利用ClustalX软件进行序列比对；采用MEGA5.1软件分析基于ITS2序列的供试物种间遗传距离，并构建基于Kimura 2-parameter （K2P）模型和Neighbor-Joining（NJ）邻接法构建系统发育树（1 000次重复bootstrap检验各分支的支持率）。

2 结果与分析

2.1 DNA提取和PCR扩增

由于本研究采集的巴戟天植物样本存在生长年限、生长阶段以及化学成分含量等差异，利用通用植物DNA提取试剂盒提取的巴戟天DNA效果不尽相同，但巴戟天DNA样品在琼脂糖凝胶电泳上均显现出目的条带（图1），可用于后续实验。

以上述巴戟天DNA样品为模板，经PCR扩增获得约500 bp的ITS2片段（图2），与预期相符合。将PCR产物纯化后送样测序，并将获得的序列提交Genbank（登记号见表1中的KJ000533、KJ000534）。

2.2 序列差异分析

本研究所获巴戟天及其混伪品ITS2序列共有22条，序列长度为224～244 bp，GC含量范围为59.8%～70.1%。所有ITS2序列比对后的长度为253 bp，其中巴戟天及其8种混伪品存在155处变异，鉴别信息位点为151个；巴戟天的7条序列仅存在2处变异，分别为26 bp的C-T和46 bp的G-A变异（图3），表明巴戟天与伪品间的差异程度远远高于巴戟天种内变异水平。

2.3 遗传距离分析

基于K2P模型计算的巴戟天及其混伪品遗传距离如表2所示，巴戟天种内K2P遗传距离为0.005～0.010。在种间，最大的种间K2P遗传距离来源于巴戟天与铁箍散，达0.771，最小的种间遗传距离则来自巴戟天与同属的假巴戟天和羊角藤，为0.025。巴戟天与伪品间的遗传距离远大于巴戟天种内遗传距离，说明在ITS2序列中有足够的差异鉴别巴戟天以及混伪品。

2.4 聚类分析

基于ITS2条形码构建的巴戟天与8种混伪品的聚类树如图4所示，22个样品主要聚成4个分支。巴戟天的全部样品首先单独聚在一起，然后再与同属的假巴戟、羊角藤和鸡眼藤聚成一支，随后再与同科虎刺属的虎刺、短刺虎刺聚集，这与传统分类结果相一致。其余3种伪品与巴戟天差异较大，另外聚成2个分支。各分支支持率均在90%以上，表现出明显的单系性，而且区分效果良好，可见ITS2条形码能够很好鉴定巴戟天及其混伪品。

3 讨论与结论

DNA条形码（DNA barcoding）技术在2003年由分类学家Hebert等[6]提出，是利用一段较短的标准DNA序列来实现物种的快速、准确鉴别。迄今为止，已有多种核片段和质体基因及其组合被提议为植物DNA条形码[7]。其中，ITS2条形码在来源于753个属4 800个种的6 000余个药用植物样品的鉴定成功率高达92.7%，被认为是药用植物通用DNA条形码[4]。目前，ITS2条形码已经广泛应用于砂仁[8]、青天葵[9]、两面针[10]等多种岭南道地药材的真伪鉴别。本研究利用变异程度较大的ITS2条形码也成功区别巴戟天及其8种常见混伪品，而且ITS2条形码长度较短（250 bp左右），大大降低了DNA提取、PCR扩增和测序的难度，有利于发生降解的药材样品的序列获取。

DNA条形码技术以物种遗传信息为鉴别依据，不受物种发育阶段和药材状态的限制，摆脱了传统鉴定方法对专业背景的要求，有利于非分类学专业人员对中药材进行快速、准确的鉴定。陈士林[11]应用ITS2条形码等序列完成了2010版《中国药典》中200多味中药材的真伪鉴别，而且国家药典委员会在2012年公布了《中药材DNA条形码分子鉴定指导原则》，说明DNA条形码具有良好的推广和应用价值。DNA条形码或会接棒传统鉴别方法，这将是中药分子鉴定方法学上的创新，对传统医药的国际化也有着推动作用。

本研究建立起巴戟天及其混伪品基于ITS2条形码的鉴别体系，为巴戟天的真伪鉴别和用药安全提供了保障，也可为DNA条形码作为药典收载巴戟天鉴别标准提供一定的参考。

参考文献

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[8] 韩建萍， 李美妮， 石林春， 等. 砂仁及其混淆品的ITS2序列鉴定[J]. 环球中医药， 2011， 4（2）： 99-102.

[9] 黄琼林， 马新业， 何 瑞， 等. 基于条形码ITS2序列的青天葵及其混伪品分子鉴别[J]. 生物技术通报， 2012（12）： 173-181.

[10] 陈贝贝， 宋经元， 姚 辉， 等. 基于ITS条形码的两面针药材及其混伪品的鉴别[J]. 中草药， 2013， 43（15）： 2 150-2 154.

[11] 陈士林. 中药DNA条形码分子鉴定[M]. 北京： 人民卫生出版社， 2012.

责任编辑：黄 艳