樱桃番茄种质资源亲缘关系的InDel和SSR标记分析

郭爽等

摘 要 选用18对InDel引物和15对SSR引物对30份樱桃番茄高代自交系育种材料进行遗传多样性分析。多态性分析结果表明，InDel标记比SSR标记的多态性低；遗传距离分析结果表明，30份樱桃番茄种质材料两两间的遗传距离（GD）在0.052～0.993之间，平均遗传距离仅为0.391，遗传距离小于0.5的种质材料占到了77.24%。在相似系数为0.65的水平上，可将30份樱桃番茄材料分为3类。

关键词 樱桃番茄；亲缘关系；InDel标记；SSR标记

中图分类号 S641.2 文献标识码 A

Phylogenetic Relationship Analysis of Cherry Tomato

Germplasm Using InDel And SSR Markers

GUO Shuang， ZHANG Suping， QIU Manyu， LIU Yuping， WU Bei

Guangzhou Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510308， China

Abstract Eighteen InDel and 25 SSR primers were used to study the genetic diversity among 30 cherry tomato germplasm resources. The result of polymorphism analysis indicated that InDel markers showed lower polymorphisms than SSR markers. The genetic distance of 30 cherry tomato materials was 0.052～0.993. The average genetic distance was 0.391. Germplasm materials with genetic distance less than 0.5 accounted for 77.24%. The result of cluster analysis showed that 30 cherry tomato germplasm resources could be classified into 3 groups.

Key words Cherry tomato； Phylogenetic relationship； SSR markers； InDel markers

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.002

樱桃番茄（Lycopersicon esculentum Mill. var. cerasiforme Alef.）又名小西红柿、圣女果，为茄科番茄属一年生草本植物，是一种水果型蔬菜，集水果、蔬菜、观赏于一体，深受广大消费者青睐。目前樱桃番茄生产中，国外品种占据我国主要市场，因此加强拥有自主知识产权、能参与国际市场竞争的樱桃番茄新品种的选育具有重大意义。遗传多样性是作物育种与改良的重要基础。但樱桃番茄是一种严格的自花授粉植物，在长期的育种实践中，樱桃番茄的遗传背景逐渐变窄。因此，丰富的种质资源对樱桃番茄新品种的选育极其重要。

随着番茄基因组序列的公开，基于全基因组重测序的InDel标记，因其具有在基因组内分布广、密度高、变异稳定、多态性强、检测容易等优点，受到越来越多关注。目前基于全基因组的InDel标记在水稻[1]、玉米[2]、番茄[3]、黄瓜[4]等作物中已有应用，但在樱桃番茄作物上的应用尚无报道。

本研究通过分析InDel标记和SSR标记在30份樱桃番茄种质资源中的多态性，探索InDel标记在樱桃番茄分子育种中的应用潜力。同时通过对现有的高代自交系材料进行聚类分析，明确供试材料间的遗传距离，旨在为樱桃番茄利用杂交优势进行品种选育和改良育种提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验共选择了30份樱桃番茄育种材料（表1），均是广州市农科院多年收集并分离自交纯化的高代自交系材料。其中27份为无限生长类型，3份为自封顶类型。樱桃番茄果形涉及圆形、高圆形、长圆形、梨形等；果色有红色、绿色、黄色、浅黄等。2012年8月4日播种于广州市农科院花都实验基地，9月1日定植，待幼苗长至6～7片真叶时，混株取3～4片嫩叶于2 mL离心管中，-20 ℃保存，以备提取DNA。

1.2 试验方法

利用15对SSR引物和18对InDel特异引物对樱桃番茄种质材料进行遗传多样性分析。引物序列由中国农业大学蔬菜学系杨文才教授提供，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.1 DNA提取 采用改良的CTAB法[5]提取樱桃番茄总DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA条带的完整性，UV9100B型紫外可见分光光度计测定吸光度值，检测纯度和浓度，并将其稀释为20 ng/μL，-20 ℃下保存备用。

1.2.2 PCR扩增 扩增反应在Thermo PX2 PCR仪上进行，反应体系25 μL，包括2.5 μL 10×PCR buffer、1.6 mmol/L MgCl2 1.5 μL、0.2 μmol/L dNTPs 2 μL、0.36 μmol/L 引物正反向各1 μL、2.5 U Taq酶0.2 μL、20 ng/μL模板DNA 1 μL、ddH2O 15.8 μL。PCR的反应过程为：94 ℃预变性3 min，然后为94 ℃变性1 min，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40个循环，最后72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物在质量分数6%变性聚丙稀酰胺胶上电泳，银染检测。

1.3 数据分析

在扩增产物电泳图谱中的同一迁移位置上按条带有无分别赋值，有扩增条带的标记为1，无扩增条带的标记为0，得到各样品带型分布表。

根据公式PICi=1-Pij2来计算引物的多态性信息含量（Polymorphism information content，PIC），公式中，Pij表示标记i的第j个带型出现的频率，标记i的总带型从1到n。

采用NTSYS pc-2.10软件进行聚类分析。对原始矩阵用Similarity程序中的Genetic distance计算样本间的遗传距离，并获得遗传距离矩阵。用Clustering程序中的SAHN程序进行聚类分析，并通过Graphics程序中的Tree plot模块生成聚类图。

2 结果与分析

2.1 SSR标记分析

15对SSR引物对30份樱桃番茄种质材料的分子标记鉴定结果表明（表2），共有13对引物可以在樱桃番茄种质材料上扩增出条带，其中11对引物具有比较清晰的多态性条带，产生多态性扩增的引物比率为84.6%。13对引物共扩增出52条带，多态性带42条，占总条带数的80.77%，扩增片段大小在100～1 000 bp之间。平均每对引物可扩增出4条带，其中扩增条带最多的引物为SSR13，共6条带；扩增条带最少的为SSR32和SSR43，仅有2条带。各引物多态性信息含量（PIC）分布在0.66～0.92之间，平均为0.68。引物SSR13的PIC值最大，为0.92，这对引物在本试验的样本群体中具有较好的多态性。

2.2 InDel标记分析

从18对InDel引物中挑选出12对在30份樱桃番茄材料都能产生清晰条带的引物（表3）。这12对引物共扩增出38条带，其中多态性条带22条，占总条带数的57.9%。平均每对引物可扩增出3.2条带，提供1.8个多态性位点。这12对引物扩增到的等位基因数在2～5之间，其中扩增条带最多的引物为SL20210i，共5条带，提供4个多态性位点。平均每个引物对产生的多态性条带比率（PPB）为52.5%。各引物多态性信息含量（PIC）分布在0.52～0.87之间，平均为0.52。与SSR标记的平均多态性信息含量（PIC）相比，InDel标记的多态性水平较SSR标记的多态性低。

2.3 基于SSR和InDel标记的遗传距离分析

遗传距离是衡量样品间相似程度的度量，遗传距离数值越大表明材料间的差异越明显[6]。30份樱桃番茄种质材料两两间的遗传距离（GD）在0.052～0.993之间，平均遗传距离为0.391。编号12与编号13 2份材料之间的遗传距离最小，仅为0.052，因为这2份材料是从同一株系分离出的姐妹系，尽管在果实大小方面存在一定差异，但是从分子水平检测，两者的遗传背景还是较相近的，推测这2份材料外观水平上的差异可能是由于环境因素造成的；编号3与编号17 2份材料之间的遗传距离最大，为0.993，这2份材料从外观上看，在果色和果实大小上就存在较大差异。总体来看，30份樱桃番茄种质材料两两间的遗传距离呈偏态分布（图1），遗传距离小于0.5的种质材料组合占到了77.24%，表明现有樱桃番茄种质材料的遗传背景较狭窄。两两间遗传距离大于0.7的种质材料共有16对，表明这些材料间的遗传差异较大，亲缘关系较远，可以据此指导田间的育种实践，为田间亲本材料的选择和选配提供科学依据。

2.4 基于SSR和InDel标记的聚类分析

30份樱桃番茄材料相似系数的变异范围在0.345～0.948之间（图2），平均为0.681。编号12与编号13的2份材料间相似系数最高，为0.948，与遗传距离计算结果相同。在相似系数为0.65的水平上，可将30份樱桃番茄材料分为三类，第一类共有12份材料，包括11份无限生长型和1份自封顶型材料；第二类共16份材料，包括14份无限生长型和2份自封顶型材料；第三类共有2份材料，均为无限生长类型。在育种实践中，可以考虑有目的地将不同类群间的种质材料配制杂交组合，一方面筛选优良组合，另一方面可以将某些优质组合继续自交纯化，创制新种质，尽可能扩大和丰富樱桃番茄的遗传背景。

3 讨论与结论

DNA分子标记技术的发展，为种质资源亲缘关系的研究和育种效率的提高提供了新的思路和途径。姚祝平等[7]利用AFLP分子标记对44份番茄材料进行了遗传多样性和亲缘关系分析，从64对引物组合中筛选出15对用于扩增，共获得364条多态性条带，将44份番茄材料分成5个复合组和1个独立组。本课题组在番茄遗传多样性的研究中，选用了育种实践中用于配制杂交杂组合的20份高代纯系番茄育种材料进行亲缘关系分析[8]，并将聚类结果指导育种实践，选育出抗青枯病番茄新品种‘益丰2号[9]。本研究选用樱桃番茄高代自交系育种材料作为供试材料，分析它们之间的遗传多样性，意在从分子水平分析这些育种材料间的遗传背景，一方面为田间育种实践提供理论依据和参考，减少杂交组合选配的盲目性，另一方面，将实验室分子水平亲缘关系分析与田间实践相结合，探寻自花授粉作物遗传背景趋于狭窄的出路。本研究选用的30份樱桃番茄高代自交系材料在其田间农艺性状上各具特色，无从取舍，亲本的选择和选配没有依据可寻。但通过基于分子水平的聚类分析，很明确地将材料聚成了三大类，在育种实践中，可以考虑有目的地将不同类群间的种质材料配制杂交组合，产生较强的杂种优势。

本研究选用的18对InDel标记中，表现多态性的有8对引物，占InDel标记总数的44.4%，而15对SSR标记中，表现多态性的有11对引物，占SSR标记总数的73.3%，表明InDel标记的多态性水平比SSR标记低很多，这与在水稻[10]、大果型番茄[3]上的研究结论相同。在番茄基因组中，虽然InDel标记数量远远多过SSR标记，但是它较低的多态性水平在一定程度上限制了InDel标记的应用范围。

本研究中，30份樱桃番茄种质材料两两间的遗传距离（GD）在0.052～0.993之间，平均遗传距离仅为0.391，遗传距离小于0.5的种质材料占到了77.24%，表明现有樱桃番茄种质材料的遗传背景较狭窄，这可能是由于驯化、育种选择[11]以及樱桃番茄自身的自花授粉特性造成的，这与申璐[3]等人的研究结论相同。因此，在樱桃番茄育种中，应注重选用外来资源，包括国外引进资源和野生资源来拓宽种质资源的遗传基础。

参考文献

[1] 姚国新， 黄文超. 利用水稻籼粳分化InDel标记鉴定育种材料的籼粳属性[J]. 杂交水稻， 2013， 28（3）： 53-57.

[2] 葛 敏， 蒋 璐， 张晓林， 等. 利用Insertion/Deletion（InDel）分子标记检测玉米互交种混杂的原理及应用[J]. 分子植物育种， 2013， 11（1）： 37-47.

[3] 申 璐， 沈炎林， 柴 敏， 等. 采用InDel和SSR标记分析番茄品种基因组DNA多态性[J]. 中国农业大学学报， 2011， 16（2）： 34-42.

[4] 李斯更， 沈 镝， 刘 博， 等. 基于黄瓜基因组重测序的InDel标记开发及其应用[J]. 植物遗传资源学报， 2013， 14（2）： 278-283.

[5] Clark. 植物分子生物学实验手册[M]. 顾红雅， 礼嘉译. 北京： 高等教育出版社， 1998： 6-9.

[6] 张爱兵， 王正军， 谭声江， 等. 分子生态学重要概念--遗传距离及其测度的理论研究概况[J]. 生态学报， 2002， 22（6）： 943-948.

[7] 姚祝平， 叶青静， 杨悦俭， 等. 番茄种质资源遗传多样性的AFLP分析[J]. 浙江农业学报， 2010， 22（2）： 156-160.

[8] 丘漫宇， 张素平， 郭 爽， 等. 番茄种质资源亲缘关系的SSR分析[J]. 中国蔬菜， 2012， （24）： 39-42.

[9] 丘漫宇， 张素平， 刘玉平， 等. 抗青枯病番茄新品种“益丰2号”[J]. 园艺学报， 2013， 40（11）： 2 321-2 322.

[10] 冯芳君， 罗利军， 李 荧， 等. 水稻InDel和SSR标记多态性的比较分析[J]. 分子植物育种， 2005， 3（5）： 725-730.

[11] Bai Y L， Lindhout P. Domestication and breeding of tomatoes： what have we gained and what can we gain in the future[J]. Annals of Botany， 2007， 100： 1 085-1 094.

责任编辑：叶庆亮