流感病毒的变异及其研究现状

谢怀根

摘要

2013年3月，我国首次出现了人感染H7N9 的禽流感疫情，给我国卫生、动物疫病防治与经济健康发展带来了严峻挑战。基于近年来禽流感等流感病毒造成的严重危害，从流感病毒的病原学、分类命名、致病性、变异特性、培养特性、临床诊断、疫苗和药物防治研究进展等方面进行了综述，以期为流感病毒的深入研究和防治提供参考。

关键词流感病毒；病原学；变异性；临床诊断；疫苗研究

中图分类号S852.65+9.6文献标识码A文章编号0517-6611（2014）28-09790-04

Variation of Influenza Virus and Its Research Status

XIE Huaigen（Nantong Center for Disease Control and Prevention， Nantong， Jiangsu 226007）

AbstractIn March 2013， China's first human infection with the H7N9 avian flu epidemic has brought serious challenges to China's health， animal disease prevention and healthy development of economy. Based on serious harm caused by avian flu， research advances were summarized from 7 aspects of etiology， classification and nomenclature， pathogenicity， variation characteristics， training features， clinical diagnosis， vaccine and drug prevention， so as to provide reference for diagnosis and control of influenza virus.

Key wordsInfluenza virus； Etiology； Variability； Clinical diagnosis； Vaccine research

流行性感冒病毒（Influenza virus）是一種RNA病毒，隶属正粘病毒科（Orthomyxoviridae），人类和动物感染后引起流行性感冒。据世界卫生组织统计，每年全世界发生流感病例为6～12亿，其中约有300～500万例为重症流感患者，有25～50万例因流感而死亡[1]，并造成数以万计的动物死亡及巨额的经济损失。

我国于2013年3月首次发现人感染H7N9禽流感病例。据统计，截至2013年12月30日，上海、安徽、江苏、浙江、北京、河南、山东、江西、湖南、福建、河北、广东等12省（市）及香港共报告确诊病例147例，其中46例为死亡病例。2013年5月，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所陈化兰研究员和她的科研团队发现导致我国人感染的新型H7N9流感病毒与同一时期存在于活禽市场上的H7N9禽流感病毒高度同源，并首次在国际上从病原学角度揭示了新型H7N9流感病毒的来源。2013年7月，陈化兰等研究发现H7N9病毒对禽类无致病力，但该病毒侵入人体后发生突变，对哺乳动物的致病力与水平传播能力明显增强，从而揭示了H7N9病毒存在较大的大流行风险[2-3]。全世界流感疫情的连续发生不但造成了人类死亡数量的不断攀升，而且给我国卫生、动物疫病防治与经济健康发展带来了严峻的挑战。基于近年来禽流感等流感病毒造成的严重危害，笔者从流感病毒的病原学、分类命名、致病性、变异特性、培养特性、临床诊断、疫苗和药物防治研究进展等方面进行了综述，以期为流感病毒的深入研究和防治提供参考。

1病原学

流感病毒是分节段的单股负链RNA病毒，主要分为甲（A）、乙（B）、丙（C）3种类型。根据表面抗原血凝素（Hemagglutinin，缩写为HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase，缩写为NA） 可对A型流感病毒进一步划分，HA有16个亚型， NA有9个亚型， HA和NA排列可以组合成多达144个病毒亚型。根据最新研究报道， Suxiang Tong等从蝙幅体内分离并鉴定出1种新型流感病毒，HA和NA与目前存在的亚型差异显著，被划分为H17和N10亚型[4]。但是，针对关于H17和N10的确切分类还存在一定争议，还需进一步研究证实[5]。B型、C型流感病毒则不再划分亚型。其中，甲型流感病毒抗原性易发生变异，病毒粒子呈球形，也可呈丝状，直径大约在80～120 nm，有囊膜。2009年，日本科学家研究发现甲型H1N1流感病毒呈细长型，这种病毒更容易附着在人体黏膜组织，变异也更为容易，该型病毒更是曾多次引起世界性流感大流行，造成了巨大的危害。例如，在1918～1919年的流感病毒大流行中，全世界死亡人数共计有2 000万～5 000万[6]。通常流感病毒的易感性受宿主限制，几乎所有亚型的A型流感病毒都可以感染鸟类，但感染人类的主要是H1、H3亚型，也有感染猪、马的报道。B型流感病毒基因结构型虽与A型相似，但仅感染人类和海豹。C型流感病毒仅散发存在，可感染人类和猪[7]。

甲型、乙型、丙型流感病毒分别于1933年、1940年、1949年分离获得。甲型、乙型、丙型流感病毒不仅在核蛋白和基质蛋白的抗原性上存在较大差异，在基因组、致病性及宿主范围方面也有较大差异。甲型、乙型流感病毒的RNA由8个节段组成，而丙型流感病毒由7个节段组成，其中第1、2、3个节段编码的是RNA多聚集酶，第4、5、6、7、8个节段分别编码血凝素、核蛋白、神经氨酸酶、基质蛋白、具有拼接RNA功能的非结构蛋白。丙型流感病毒缺少第6个节段，但其第4节段编码的血凝素可以同时具备神经氨酸酶的功能。

2致病性

流感病毒的传染源范围较广，包括感染或发病的人类或畜禽，携毒的野生鸟类和迁徙性的水禽都可引起该病毒的传播。流感病毒可以通过直接接触带毒者或与其分泌物、排泄物、污染的饲料、水等间接接触而传播[8]。通常情况下，由于不同物种自身具有的受体不同，流感病毒很少感染其他物种。但是，有时流感病毒能通过基因突变或重组改变生物学特性，从而造成跨种传播。传播途径主要有经消化道、呼吸道传播，也可通过气源性媒介传播，也存在垂直传播的可能[9]。

流感病毒一般只引起表面感染，不引起病毒血症。感染流感病毒主要表现呼吸道症状，呼吸道粘膜上皮细胞为流感病毒侵袭的主要侵袭靶标，但也有感染肠粘膜引起胃肠型流感的病例。病毒侵入机体内后依靠血凝素吸附于宿主细胞表面，经过吞饮作用方式进入胞浆，进入胞浆之后病毒包膜与细胞膜融合释放出包含的ss-RNA，ss-RNA的8个节段在胞浆内编码RNA多聚酶、血凝素、核蛋白、神经氨酸酶、基质蛋白、膜蛋白、非结构蛋白等单元构件，其中血凝素、神经氨酸酶、基质蛋白、膜蛋白等編码蛋白在内质网或高尔基体上组装M蛋白和包膜，在细胞核内病毒的遗传物质不断复制并与核蛋白、RNA多聚酶等组建病毒核心，最终病毒核心与膜上的M蛋白和包膜结合，经过出芽释放到细胞之外，复制周期大约8 h。流感病毒感染将导致宿主细胞变性、坏死乃至脱落，造成粘膜充血、水肿和分泌物增加，从而产生鼻塞、流涕、咽喉疼痛、干咳以及其他上呼吸道感染症状，当病毒蔓延至下呼吸道，则可能引起毛细支气管炎和间质性肺炎。病毒的存活时间因外界的环境条件不同而有差异，在水中能保持很强的感染持续能力。例如，在17 ℃的水中病毒的感染性能持续约100 d左右，而在-50 ℃以下病毒可以长期保存。

3变异特性

大流感和季节性流感暴发的基础是流感病毒的不断变异。抗原性变异、敏感性变异（温度、对非特异性抑制物等）和宿主范围等方面的变异都是流感病毒变异主要方式，但流感变异最主要的是抗原性变异。抗原性变异的显著特点是表面抗原HA和NA易发生变异。针对旧毒株的免疫应答对新毒株的效果可能会减弱甚至完全无效的原因是流感病毒通过抗原不断进化以逃避宿主的免疫反应。因为中和抗体的靶点是HA，其突变对免疫逃逸最为关键，而其他病毒抗原变异所引起的效应则没有HA显著，但在一定的免疫选择压力下也可能会导致免疫逃逸[10]。

甲型流感病毒表面抗原血凝素（HA）是镶嵌在病毒脂双层膜上的1个主要表面糖蛋白，以三聚体形式存在，由约566个氨基酸构成。表面抗原血凝素（HA）蛋白在感染初期与宿主细胞表面的特异性受体相结合，它是流感病毒能否入侵宿主的关键蛋白之一，同时还介导被胞吞的病毒外膜与宿主细胞核内体膜的融合。另外，表面抗原血凝素（HA）蛋白还可刺激宿主机体产生中和抗体，进而产生免疫应答保护作用。因此，流感病毒能逃脱宿主免疫监视而导致流感的季节性流行是表面抗原血凝素（HA）蛋白的高度易变性所造成的。

Munster等将H5高致病性禽流感HA的MBCS插入低致病性的H6N1禽流感病毒中，造成了体外表达的HA前体在没有胰蛋白酶的条件下也能被裂解以及H6N1病毒对鸡的高致病性[11]。但是，Bogs等将高致病性H5N1禽流感病毒的HA多碱性氨基酸序列取代低致病性H5N1禽流感病毒的单个碱性氨基酸裂解位点却发现这个改变虽然增加了病毒的感染能力但并不影响病毒对鸡的致病性。据此推测，多碱性氨基酸序列HA裂解位点的获取只是H5N1禽流感病毒从低致病性到高致病性演变过程中的必要步骤之一，其高致病性还取决于HA 裂解位点以外氨基酸的改变和其他病毒蛋白[12]。

流感病毒的神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）是镶嵌在流感病毒脂双层膜上的另一个糖蛋白，由病毒基因组第6个节段RNA编码的470个左右氨基酸构成并以四聚体形式存在。NA蛋白依靠氨基酸残基7～35疏水区域镶嵌在脂膜上，氨基酸残基36～73构成了NA蛋白的颈部，而其余的氨基酸残基形成了NA蛋白的头部[5]。酶活性中心和抗原决定区域都位于NA蛋白的头部顶端，与活性中心相关的11个氨基酸在9种NA亚型中都是保守的（Arg118、Glu119、ASP151、Arg152、Trp178、Ile222、Arg224、Glu276、Arg292、Arg371和Tyr406）。NA蛋白不需经过翻译后的加工，其主要功能是清除糖蛋白或糖脂链上的唾液酸残基，催化裂解末端唾液酸和半乳糖之间的连接键以帮助子代病毒颗粒脱离被感染的宿主细胞。NA也是流感病毒易发生变异的两个主要表面抗原之一[13]。NA基因不同位点的突变与流感病毒的致病性密切相关，而且NA的活性高低还与病毒感染后继发肺炎发生的频率及严重程度有关。能抑制流感病毒NA的抗体或药物就应该能抑制流感病毒的复制。抗流感新药达菲（Tamifiu）正是根据这个原理以及唾液酸结合于NA活性中心的X-光晶体结构设计合成出来的。

针对流感病毒的变异性，一些研究者认为流感病毒的变异是由于人群中传播的流感病毒面临较大的免疫压力，促使病毒核酸不断发生突变。而另一些科学研究者认为，流感病毒的变异是由于人甲型流感病毒和禽流感病毒同时感染猪后发生基因重组导致病毒的变异。进一步研究表明，1957年流行的亚洲流感病毒基因的8个节段中有5个节段来自H1N1人流感病毒，而其余3个是来自鸭流感病毒，该研究发现证实了基因重组导致病毒变异的可能性。流感病毒的高度变异性极大地增加了对流行性感冒的防治难度，准确预测即将流行的病毒亚型变得很困难，因此有针对性地进行疫苗接种变得很难实施。

4培养特性

流感病毒可在鸡胚羊膜腔和尿囊腔中增殖。增殖的病毒游离于羊水或尿囊液中，检测可用红细胞凝集试验法。虽然流感病毒也可在组织培养细胞（人羊膜、猴肾、狗肾、鸡胚等细胞）中增殖，但不引起明显的CPE。使用MDCK（狗肾）细胞分离流感病毒的试验方法，是常规流感检测及病毒研究的关键技术，由于不同的MDCK细胞株均有各自的生长特点，流感病毒对其侵袭力及在该细胞上的繁殖条件均有所差异。

余钧池等[14]研究发现流感病毒在MDCK细胞中最佳培养条件是直接接种流感病毒于病毒生长液，置于35.5 ℃、5%CO2培养箱培养96 h。其中，病毒生长液中无胎牛血清、胰酶终浓度为2.5 μg/ml。含有流感病毒的细胞传代次数应控制在4代以内。收获流感病毒前，将细胞反复冻融1～2次，可提高病毒的HA滴度，收获的病毒应放置于-80 ℃冷冻保存。

流感病毒在小鼠中连续传代可提高毒力，作用于小鼠肺部可发生广泛的实质性病变或死亡。流感病毒不耐热，抵抗力较弱，在56 ℃条件下作用30 min即可杀灭病毒。在0～4 ℃能存活数周，因此，冬、春季是流感的常发季节。

5实验室诊断

实验室诊断的常用方法是分离病毒及血清学试验。其中，分离病毒最好从活体采集鼻粘膜拭子样品，另外发热期比退热后更容易在鼻腔和咽部分泌物中分离出病毒。也可从死亡或急性期剖杀的猪肺组织中分离病毒，培养时将肺组织磨碎，悬浮在盐水中。将病料接种10龄鸡胚，在35 ℃孵化72 h后收集尿囊液，测定其凝集鸡红细胞的能力。血清学试验猪流感血清学诊断需采双份血清样品，1份在急性发病期采集，另1份在此后的3～4周采集，如果抗体水平升高则为判定为流感病毒阳性，在诊断时用血凝抑制（HI）检测抗体是最常用的方法。上述2种方法具有准确、敏感、可重复操作的优点，但耗时较长，不能满足疾病快速方便检测的需要。申伟霞等通过比对GenBank网站上H3、H9亚型禽流感病毒HA 基因序列，设计了分别针对H3 AIV 和H9 AIV 的特异性探针，建立了H3、H9亚型禽流感病毒双重荧光定量PCR方法具有较高的临床应用价值。

另外，检测该病毒和病毒抗原或特异性抗体的方法还有酶联免疫吸附试验（ELISA）、多聚酶链式反应（PCR）、肺组织直接免疫荧光技术、细支气管肺泡冲洗物免疫荧光显微镜技术、鼻腔上皮细胞间接免疫荧光技术、固定组织的免疫组化检测技术。

6疫苗与药物的防治研究进展

6.1疫苗研究

目前流感预防最为常用的措施是流感疫苗接种，目前被广泛使用的疫苗主要有2种：减毒活疫苗和三价灭活疫苗。每年减毒活疫苗和三价灭活疫苗都被用于预防预期发生的优势流感病毒株，疫苗的接种可以有效减少接种者感染流感的机会或者减轻流感症状，这2种疫苗都含有选定的H1N1、H3N2和B型这3种灭活或者致弱的流感病毒[15-17]。减毒疫苗含有已致弱的病毒，喷鼻接种是其主要的接种方式[18]。减毒疫苗是用一种冷适应的病毒骨架和当年选定疫苗毒株的HA、NA重组制成的疫苗，重组的毒株对温度比较敏感，可在鼻咽中有效复制，但在呼吸道和肺中等稍高温度处受限，该机制不但可以有效诱导免疫保护，而且不会对机体造成伤害。临床研究表明，匹配的减毒活疫苗可达到80%以上的保护率[19]。

三价灭活疫苗的生产通过鸡胚培养，但由于流感病毒在鸡胚中传代得率不高，所以通过反向遗传学系统将所选毒株的HA和NA与在鸡胚中高产的PR/8/34毒株重组可明显提高得率，加速疫苗生产过程[20-21]。另外，通过利用细胞培养法生产疫苗方便了对野生病毒的操作，避免了病毒在适应鸡胚过程中易产生HA突变的问题，加快了对突发大流感疫苗的制备速度，且在密闭系统中发酵的过程更容易控制[15]。在改善全病毒灭活疫苗的措施中佐剂的有效添加也可起到良好的辅助作用，目前包括憐脂质和水包油乳剂等佐剂的季节性流感疫苗已经在欧洲批准上市[22-23]。减毒疫苗与三价灭活疫苗相比免疫力更强，持续时间也更久，但具有潜在的回复毒力而致病的风险，对免疫系统较弱的群体不推荐使用[19]。

据报道，现已进入临床试验阶段的疫苗种类还包括DNA疫苗（DNA-based vaccines）、通用疫苗（Universal vaccines）、重组蛋白疫苗（Recombinant proteins）、病毒样颗粒（Viruslike particles）、病毒载体（Viral vectors）。这些疫苗在动物试验中产生了良好的免疫效果，一些已经应用到临床中[24-26]。

流感病毒流行毒株变异频率高，当年应用的疫苗需要根据上一个流行季节的优势毒株作出调整、更换每年生产的疫苗，但传统减毒活疫苗和三价灭活疫苗的大规模研发和生产制造周期至少需要6个月时间，因此疫苗研发存在一定的滞后性。特别是在大流感急速暴发时，其滞后性缺陷更加显现， 因此，迫切需要研制出新型疫苗以便为流感病毒的预防提供有力的保障，希望不久的将来可以有更多的新型疫苗研制成功并得到广泛应用。

安徽农业科学2014年

6.2抗病毒药物的研究

6.2.1

化学药物抗流感病毒的研究。

疫苗的研发和制备相对滞后，并且现有的疫苗只能用于流感的预防，没有治疗效果，因此抗流感病毒化学合成药物的研制成為科学研究的重难点。Mark von Itzstein等在1989年设计并合成了4-guanidino-4-deoxy-Neu5Ac2en（称为Zanamivir），它与神经氨酸酶（NA）的亲和力是疫苗接种的104倍，并且能够竞争性抑制所有A型和B型流感病毒。 Zanamivir抗流感病毒的机制是仅选择性地抑制流感病毒的神经氨酸酶（NA），而其高度选择性的抑制可有效避免潜在的副作用的发生，如对机体内正常神经氨酸酶（NA）功能的抑制[27]。1999年，作为第一个流感病毒神经氨酸酶抑制剂（NA）被美国食品药物监督管理局（FDA）批准上市销售，主要用于A型和B型流感病毒的治疗。

在临床治疗过程中发现，Zanamivir是一个两性分子，极性大，虽然在体内的代谢很快，但其口服生物利用度却很低，仅达到2%～3%，通过吸入器吸入方式给药虽然可以提高利用度，但是具有呼吸系统疾病或者老幼患者使用十分不便。另一方面，虽然针对Zanamivir的耐药毒株较少，但是其给药方式的缺陷极大限制了其大规模使用。

1997年，Kim等通过对Zanamivir分子的改造，合成可以口服的药物Oseltamivir，其口服生物利用度可以达到80%，极大改善了Zanamivir口服利用度不高的问题。体外活性试验表明，Oseltamivir对A型、B型流感病毒神经氨酸酶（NA）的半数抑制浓度都能达到纳摩尔级水平。1999年9月，Oseltamivir phosphate 以商品名 Tamiflu （中文名为达菲）在瑞士上市销售，主要用于治疗A型和B型流感。片剂的达菲是第一个口服活性高的流感病毒神经氨酸酶（NA）抑制剂。

虽然FDA批准上市的Oseltaniivir和Zanamivir 2种流感病毒神经氨酸酶抑制剂， 随着大流感的广泛传播和每年季节性流感的暴发发挥了重要社会价值，但随着给药的增多，也出现了越来越多的耐药毒株。耐药毒株表现主要是神经氨酸酶（NA）的酶活位点与抑制剂的亲和力降低，常见耐药突变有2种类型：1种是NA骨架位点氨基酸突变，如E119V、H274Y、N294S 和 D198N[28]；另1种是NA和唾液酸直接结合的位点氨基酸突变，如R292K和R152K。

在2009年发生的甲型H1N1大流感期间由 BioCryst Pharmaceuticals 公司开发用于治疗流感的新型药物Peramivir被批准用于对特定病例的紧急治疗。 Peramivir是目前唯一通过注射给药的抗流感病毒NA药物[29]。另外，新型抗流感病毒神经氨酸酶（NA）药物Laninamivir于2010年在日本被批准上市销售，可以用于治疗A型和B型流感。

张国防等[30]通过表达纯化获得了流感病毒H5N1的PAN 蛋白，通过高通量药物筛选体系，从372 种化合物中筛选出3 种对PAN 蛋白有抑制作用的化合物，其IC50值分别是56、35.5和83.3 μmol/L。

另外，科研人员对MS-257的设计以及针对NA流感病毒神经费酸酶150-洞的抑制剂设计，都已取得了突破，相信通过科研人员的不懈努力，肯定能为流感病毒的治疗提供新的治疗药物。

6.2.2

中药制剂抗流感病毒的研究。

中药为天然药物，含有生物碱、黄酮、多糖等多种有效生物活性物质。针对一些单味中草药抑制或杀灭病毒的作用研究发现，单味中草药可以在病毒繁殖的吸附、穿入、复制、成熟过程中的某一单元发挥阻断作用，进而达到病毒杀灭的目的。目前针对中草药在抗流感病毒作用机理研究方面，其成分阐明清楚的有2类：一类是多酚类物质，它们可以抑制流感病毒蛋白质和RNA合成，同时也可抑制流感病毒的吸附作用；另一类是黄酮类物质，它们可以抑制流感病毒唾液酸酶的活性和膜融合作用。主要的代表药物包括大青叶、黄连、黄芩、鱼腥草、板蓝根、连翘、金银花等。另外，研究表明许多中药不但能够直接抑制病毒的繁殖，而且能在间接抑制病毒繁殖的过程中发挥作用[31]。越来越多的中药方剂在防治流感方面显示出很好的治疗效果。但是针对某个有效的、能够广泛应用于临床的理想方剂作用機理方面的研究还处于空白，其主要原因可能有以下方面：一方面是缺乏中药的基础研究，另一方面是针对如何认识、解决中药治疗疾病与西药评价体系一致性的问题还存在争论。中药是否需要与西药用相同的评价体系，如何建立完善中药有效成分方剂质量标准等都是迫切需要考虑和解决的问题。

流感病毒的抗原变异仍然是目前研究较多的重要课题。目前， 应用分子生物学技术对此研究提供了良好手段， 对流感病毒抗原变异的机理也有了一定的了解，但这还很不够，还有许多问题有待深入研究。

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