中度嗜盐菌玁esterenkonia 玸p.DF1产淀粉酶发酵条件优化的研究

张杰　刘永强 娄虎 郭瑞 刘雪峰

摘要

[目的]摸索出Nesterenkonia sp.DF1菌种的产淀粉酶的优化发酵条件，为发酵工业中淀粉酶的大规模生产提供理论依据。[方法] 采用单因素和多因素正交试验的方法，考察发酵时间、温度、初始pH、盐度、碳源和氮源的改变对发酵产淀粉酶的影响。[结果]在装液量100 ml/250 ml条件下， 得到产淀粉酶最佳条件为：玉米粉1%，酵母膏2%，初始pH 8.0、NaCl浓度3%、37.5 ℃、160 r/min振荡培养72 h。[结论] 该研究找到了产淀粉酶的最佳发酵条件。

关键词中度嗜盐菌；淀粉酶；发酵条件；优化

中图分类号Q938；S188+.4文献标识码A文章编号0517-6611（2014）28-09664-03

Optimizing Fermentation Conditions for Amylase Production Using Moderately Halophilic Bacterium Nesterenkonia sp.DF1

ZHANG Jie1， LIU Yongqiang2， LOU Hu1， LIU Xuefeng3* et al

（1. College of Life Sciences， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040； 2. Daqing City Center for Disease Control and Prevention， Daqing， Heilongjiang 163311；3.Forestry College，Northeast Forestry University，Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract[Objective] It was necessary for Nesterenkonia sp.DF1 to optimize the fermentation conditions for production of amylase in order to provide theoretical basis for the mass production of amylase in fermentation industry. [Method] The single factor method and multifactor orthogonal experiment were adopted to investigate the effect of a set of variables， including fermentation time， temperature， initial pH， salinity， the change of carbon source and nitrogen source upon the influence of fermentation to produce amylase. [Result] When liquid medium volume was 100 ml/ 250 ml， the optimal fermentation conditions were corn meal 1%， yeast extraction 2%， initial pH 8.0， NaCl concentration 3%， temperature 37.5 ℃ and shaking culture for 72 h at 160 r/min. [Conclusion] The best fermentation conditions for Nesterenkonia sp.DF1 to produce amylase were obtained.

Key words Moderately halophilic bacterium； Amylase； Fermentation conditions； Optimization

目前國内对于嗜盐菌产淀粉酶、酯酶、脂肪酶的相关报道很多，但这些菌大多数属于极端嗜盐菌，如Halobacterium sp.H371[1]、Halorubrum sp.CY[2]、Haloferax mediterranei R4[3]和Natronobacterium sp.C212[4]等，对于中度嗜盐菌产生的酶方面的研究还不是很多，而且目前尚没有对Nesterenkonia属菌所分泌的胞外淀粉酶进行系统的酶学性质和发酵条件优化研究。该研究弥补了这方面的不足，为发酵工业中淀粉酶的大规模生产提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1

菌种。该实验室分离的中度嗜盐菌高产淀粉酶的菌种Nesterenkonia sp.DF01。

1.1.2

培养基。种子培养基组成为：酵母粉6 g/L，酸水解酪蛋白5 g/L，蛋白胨6 g/L，KCl 3 g/L，柠檬酸钠3 g/L， FeSO4 0.001 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L， NaCl 30～120 g/L（不同盐度梯度），加蒸馏水至1 000 ml。淀粉酶发酵培养基组成为：酸水解酪蛋白5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨6 g/L，酵母粉6 g/L，KCl 3 g/L，柠檬酸钠3 g/L，FeSO4 0.001 g/L， MgSO4·7H2O 2 g/L， NaCl视需要量，加蒸馏水至1 000 ml。

1.2方法

1.2.1

单因素试验。挑取少许单菌落，接种于种子发酵液中， 140 r/min，37 ℃摇床培养 24～48 h，制备种子发酵液，按2%的接种量接种在装有100 ml淀粉酶发酵培养基的250 ml三角瓶中， 160 r/min，37 ℃摇床培养。分别改变发酵时间、温度、初始pH、盐度，碳源和氮源，每个不同梯度样品作3个平行，取酶活性的平均值[5-6]。

1.2.2

多因素正交试验。

采用L9（34）做正交试验，选择碳源、氮源、NaCl浓度培养基和初始pH作为4个单因素，找出在多个因子共同作用（表1）下的中度嗜盐菌产淀粉酶的最佳培养条件[7-8]

1.2.3

淀粉酶活性的测定。参照文献[9]，测定淀粉酶活性。酶活性单位定义为：在最适反应条件下反应10 min，消化1 mg淀粉所需的酶量。

2结果与分析

2.1培养时间对DF01产淀粉酶的影响

由图1可知，培养0～24 h时菌体生长很慢，淀粉酶活性比较低；培养24～48 h时菌体迅速生长，淀粉酶活性越来越高；培养48～72 h时菌体生长很快，培养72 h时达到最大值，產酶量很高且保持稳定，在培养72 h时也达到最高值；培养72～96 h时菌体生长稳定，接近最大值，菌体培养到84 h之后产酶量缓慢下降；培养超过96 h时菌体生长、产酶量均有下降趋势，因此培养72 h最佳。

图1培养时间对DF01产淀粉酶的影响

2.2培养温度对DF01产淀粉酶的影响

由图2可知，当温度超过30 ℃时菌体生长迅速，当温度达到37 ℃时菌体含量最大，38 ℃时产酶量接近最大值，因此最佳的产酶温度为37.5 ℃，此时菌体生长良好，产酶量也多。

图2培养温度对DF01产淀粉酶的影响

2.3培养基初始pH对DF01产淀粉酶的影响

由图3可知，当初始pH为7.5时，菌体生长量接近最大值，产酶量呈现上升趋势；当初始pH为8.0时，产淀粉酶量接近最大值，菌体含量也接近最大值；当初始pH超过8.0时，产酶量和菌体含量均下降。因此，培养基初始pH 8.0对DF01产淀粉酶的影响最佳。

图3起始pH对产淀粉酶的影响

2.4NaCl浓度对DF01产淀粉酶的影响

由图4可知，NaCl浓度在0～3%范围内产淀粉酶量差别不大，当生长盐度为3%时菌体含量、产酶量菌接近最大值，当NaCl浓度大于5%时菌体含量和产淀粉酶量均下降。因此，NaCl浓度为3%时对DF01产淀粉酶的影响最佳。

图4NaCl浓度对产淀粉酶的影响

2.5碳源及其浓度对DF01产淀粉酶的影响

由图5可知，DF01在相同的培养条件下，以玉米粉为唯一碳源配制培养基培养菌体时产淀粉酶量最高，其次是以可溶性淀粉为唯一碳源，当以葡萄糖为唯一碳源时产酶量最低。

图5不同碳源对产淀粉酶的影响

由图6可知，碳源的添加量不同，对产淀粉酶会有很大的影响，当碳源玉米粉含量为1%时产淀粉酶量最高，超过1%时产酶量逐渐下降。

图6玉米粉添加量对产淀粉酶的影响

2.6氮源及其浓度对DF01产淀粉酶的影响

由图7可知，DF01在相同的培养条件下，以酵母膏为唯一氮源配制培养基培养菌体时产酶量最高，其次以蛋白胨为唯一氮源，当以尿素为唯一氮源时产酶量最低。

图7不同氮源对产淀粉酶的影响

由图8可知，氮源的添加量不同，对产淀粉酶有很大的影响，当氮源酵母膏含量为2%时产淀粉酶量最高，氮源含量过高或过低菌种产酶量会下降。

图8氮源添加量对产淀粉酶的影响

2.7多因子正交试验分析

由表2可知，四因素对DF01产淀粉酶产生影响的大小顺序为碳源浓度>氮源浓度>pH >NaCl浓度。根据正交试验结果，产淀粉酶最佳条件为玉米粉1%，酵母膏2%，初始pH 8.0，NaCl 浓度3%。

3结论

结合单因素和四因素三水平正交试验，在装液量100 ml/250 ml条件下， 得到产淀粉酶最佳条件为玉米粉1%，酵母膏2%，初始pH 8.0，NaCl浓度3%，37.5 ℃，160 r/min振荡培养72 h。该研究结果为今后中度嗜盐菌菌种的生产应用提供了理论基础。