贵州凤岗富锌富硒绿茶对小鼠抗氧化抗衰老作用的研究

刘华　申雪慧子　聂兰等

摘要

[目的]采用分子生物学技术，探讨贵州凤岗富锌富硒绿茶对小鼠抗氧化、抗衰老的作用及机制。[方法]腹腔注射D半乳糖建立小鼠衰老模型，空白组给予腹腔注射0.9%生理盐水。造模14 d后，根据中国营养学会推荐每日饮茶量及实验动物药物剂量比例，给小鼠灌胃富锌富硒绿茶，1次/d。连续灌胃21 d后，采用Morris水迷宫进行行为学实验。处死小鼠，采用蛋白免疫印迹法（westernblotting）检测各小鼠肝脏组织中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）的表达。采取RTPCR法，测定各小鼠肝脏组织中SOD和GSHPx的mRNA转录水平。[结果]富锌富硒绿茶对衰老小鼠学习记忆能力有一定的改善作用，并且提高SOD和GSHPx的mRNA及蛋白质表达水平（P<0.01）。[结论] 富锌富硒绿茶提高机体的抗氧化能力及免疫功能，在一定程度上具有延缓衰老的作用。

关键词富锌富硒绿茶；抗氧化；超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的表达；小鼠衰老模型；肝脏组织

中图分类号S571文献标识码A文章编号0517-6611（2014）28-09657-04

Study on Influence of Seenriched and Zincenriched Green Tea on Antioxidation and Antiaging of Mice in Guizhou

LIU Hua1， SHEN Xuehuizi1， NIE Lan2， WU Ning3*

（1. Department of Biochemistry and Molecular Biology， Guiyang Medical College， Guiyang， Guizhou 550004； 2. School of Public Health， Guiyang Medical College， Guiyang， Guizhou 550004； 3. Laboratory of Chemical and Biological Chemistry， Guiyang Medical College， Guiyang， Guizhou 550004）

Abstract[Objective] This paper focused on discussing how the Seenriched and Zincenriched green tea works on mice in antioxidation and antiaging by measuring the mRNA and protein expression level of SOD and GSHPx in liver tissue. [Method] The mice aging model was constructed by intraperitoneal injection of Dgalactose， compared with intraperitoneal injection for control group. 14 days later， the experimental mice were fed with tea solution by intragastric administration according to the daily amount of drinking tea and drug dose ratio of experimental animals recommended by Chinese Nutrition Institute. After 3week gavage， the behavior test was conducted through Morris water maze method. The mRNA expressional level of SOD and GSHPx inside the liver tissue were examined by RTPCR. The protein expression level of SOD and GSHPx inside the liver tissue were examined by westernblotting. [Result] The Se & Zincenriched green tea can exert a good influence on the improvement of the aging mices learning and memorizing ability. Meanwhile， Se & Zincenriched green tea can increase mRNA and protein expression levels of SOD and GSHPx. [Conclusion] Drinking Se & Zincenriched can improve the antioxidant capacity of mice and to an extent can slow down the aging process.

Key wordsSe & Zincenriched green tea； Antioxidant； Expression of SOD and GSHPx； Mice aging model； Liver tissue

貴州为我国绿茶的主要省份，而凤冈产茶历史悠久。唐代茶圣陆羽在他撰写的世界第一部茶书《茶经》八之出中记述：“黔中生思州、播州、费州、夷州……， 往往得之，其味极佳”。据考证，夷州治所就是今凤冈县绥阳镇。宋代《华阳国志》中“平夷产茶蜜”，乐史《太平寰宇记》“夷州、播州、思州以茶为贡”和清代《梅移随笔》“龙泉产云雾芽茶，色味双绝”中的夷州、思州、龙泉都是指今凤冈一带[1]。最新科学研究表明，富锌富硒绿茶中所含有的天然物质成分对防衰老、防癌、抗癌、杀菌、消炎等均有特殊效果，为其他茶类所不及[2]。笔者通过测定肝脏组织中SOD和GSHPx的mRNA及其蛋白质表达水平，研究富锌富硒绿茶对D半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠的抗氧化、抗衰老作用，为贵州特色茶叶产业的发展和推广提供营养保健的基础数据。

1材料与方法

1.1 试验材料和仪器

1.1.1

动物。昆明雄性小鼠70只，体重（18～25 g），购自贵阳医学院动物中心（合格证：10000S38）。

1.1.2

药物。供试富硒富锌绿茶由贵州凤冈县永安镇田坝村所产，2013年春季采摘。经贵州省山地研究所测试中心测定，该绿茶含锌、硒含量分别是65.47±0.02、1.74±0.02 mg/kg。按茶水比为2 g∶20 ml的比例，用沸水冲泡30 min制成茶水，过滤，为高浓度组；稀释1倍过滤后为中浓度组；再量取等体积水稀释，过滤后为低浓度组；普通绿茶泡制方法同前；维生素C片剂，用浓度0.9%生理盐水配制成 50 g/ml溶液。

1.1.3

试剂。D半乳糖由上海恒信化学试剂厂生产；动物组织总RNA提取试剂盒（天根，批号DP121221）；Thermo试剂盒（Fermentas公司）；6×DNA电泳Loading Buffer上样液（天根，批号BC110413）；溴化乙锭（EB）溶液（天根，批号BC120227）；DNA marker（北京康为世纪生物科技有限公司生产，批号CW0632）；浓度30%丙烯酰胺（赛兰博，批号8080）；1.5 mol/L Tris（pH 8.8）；1.0 mol/L Tris（pH 6.8）；浓度10%SDS；浓度10%过硫酸胺（APS）；TEMED；BAC法蛋白定量试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；兔抗小鼠SOD1多克隆抗体（Santa Cruz公司，批号sc11407）；兔抗小鼠GSH1多克隆抗体（Santa Cruz公司，批号sc292189）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（Santa Cruz公司，批号sc2004）。

1.1.4

仪器。凝胶成像分析仪（美国BioRad公司），酶标仪（美国BioTek公司），电泳仪（美国BioRad公司），3k15高速冷冻离心机（德国Sigma公司），T148 050900型PCR仪（德国Biometra公司），水平电泳仪（美国伯乐BIORAD公司），DolphinDoc凝胶成像系统和DolphinID软件（美国Wealtec公司），高压灭菌锅（日本三洋公司），MP200A型电子天平（上海良平仪器厂），电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂），Morris水迷宫（中国医学科学院药物所），动物运动轨迹记录分析系统（普升科技有限公司），HPLAS2000计算机图像分析系统（无憾千屏公司）。

1.2试验方法

1.2.1

动物衰老模型的构建。用浓度75%乙醇消毒小鼠下腹部，用D半乳糖（0.2 mg/g小鼠体重）腹腔注射，连续14 d，诱发衰老模型，之后连续28 d每日给予相同剂量以维持衰老模型[3-4]。空白组小鼠注射浓度0.9%生理盐水（0.1 ml/10 g小鼠体重），给药方法同模型组。

1.2.2

行为学测试（游泳水迷宫试验）。在连续灌胃21 d后，采用环形水池。水池中放一低于水面1 cm左右的逃避平台。模型小鼠预先训练4 d，每次取1、2、3、4四个象限入水点背对站台放入水池。若小鼠在60 s内找到平台，则使其停留15 s；若60 s内未找到平台，则将其诱导到平台上，并停留15 s方结束一次训练。连续训练4 d，在第5天进行行为学测试，其检测指标有：①定向航行试验，测定每只小鼠从放入水中开始到跳到逃避平台时的时间，即逃避潜伏期；②空间探索试验，测定每只小鼠穿越平台区所用时间及穿越站台次数[5-6]。

1.2.3

分组与给药。小鼠分为空白组、衰老模型组、普通绿茶组、富锌富硒绿茶（高、中、低剂量）组、阳性对照组（维生素C片），每组10只小鼠。 给药方案为：给予D半乳糖（0.2 mg/g）14 d后，普通绿茶组给予普通绿茶茶水灌胃；富鋅富硒绿茶组按照高、中、低浓度进行灌胃；模型组、空白组给予等容积蒸馏水灌胃；阳性对照组灌胃1 g/L维生素C溶液，1次/d，连续给药28 d。

1.2.4

小鼠肝脏组织SOD、GSHPx蛋白质表达水平的检测。提取肝脏组织总蛋白，取少量上清液进行蛋白定量，余下-20 ℃保存备用，制胶，然后取20 μl蛋白质样品加上样缓冲液，煮沸变性后进行SDSPAGE电泳；电转移至PVDF膜；用含浓度5%脱脂奶粉的TBST振荡封闭2 h；分别加入适量一抗4 ℃封闭过夜，次日以TBST洗膜3次，每次10 min；加二抗，室温振摇孵育2 h；洗膜后ECL法显影。以βactin为内参，条带经Kodok Digital Science ID Image Analysis Software及GDS1数字化凝胶成像分析仪扫描，计算吸光度（A）。

A比值=目的蛋白A/βactinA

式中，A比值为目的蛋白表达量的相对含量。试验重复3次，取平均值。

1.2.5

小鼠肝脏组织SOD、GSHPx mRNA表达水平的检测。用动物组织总RNA提取试剂盒提取小鼠肝脏组织总RNA，提取后取5 μl RNA对RNA纯度、浓度进行检测（提取方法严格按照说明书进行）。

RTPCR引物设计依据昆明小鼠中的SOD和GSHPx mRNA序列和βactin mRNA序列设计，经blast进行特异性确定。最后，由上海生物工程技术服务有限公司合成引物。SOD mRNA上游引物：5CTGTACCAGTGCAGGACCTCAT3，下游引物：5CACCTTTGCCCAAGTCATCTT3。该引物扩增的片段长度为221 bp。GSHPx mRNA上游引物：5GAAGTGCGAAGTGAATGGTGAGA3，下游引物：5AGTTGCCAGACTGCTGGGACA3。该引物扩增的片段长度为269 bp。βactin mRNA上游引物：5ATATCGCTGCGCTGGTCGTC3，下游引物：5AGGATGGCGTGAGGGAGAGC3。该引物扩增的片段长度为541 bp。

将提取的RNA逆转录（RTPCR）成cDNA，方法参考Fermentas公司RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit说明书。然后，以cDNA为模板，以SOD、GSHPx和βactin引物分别进行PCR反应。PCR反应体系为：ddH2O 6 μl，2×Taq PCR MasterMix 13 μl，上下引物各1 μl，上下内参各1 μl，模板2 μl。PCR扩增反应条件为94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环，最后72 ℃延伸5 min。产物在PCR反应结束后电泳，结果扫描保存。

1.2.6

统计学处理。 数据采用SPSS 17.0系统软件进行处理。计量资料采用单因素方差分析和多重比较，P<0.05差异有统计学意义。

2结果与分析

2.1小鼠衰老模型验证

2.1.1

小鼠外观。研究表明，空白组小鼠体质量正常增加；模型组小鼠从造模第28天开始，体重增加速度下降，部分毛发脱落、失去光泽，出现行动迟缓、精神萎靡不振等症状；富锌富硒绿茶高剂量组小鼠精神状态好于普通绿茶组；富锌富硒绿茶中剂量组小鼠精神一直良好，毛发光滑整齐，体重增长速度正常；富锌富硒绿茶低剂量组小鼠精神状态略好于高剂量组小鼠；普通绿茶组小鼠表现与空白组相似；阳性组小鼠表现与中剂量组相似。

2.1.2

小鼠血清验证。通过对比模型组与空白对照组，发现模型组小鼠血清中 MDA含量在0.05水平显著升高，而血清中 SOD 活力、GSHPx活力、过氧化氢酶（CAT）活力显著降低。

2.1.3

行为学测试结果。由表1可知，在定向航行试验中，与空白组相比，模型小鼠所用的逃避潜伏期较长（P<0.01）；普通绿茶组所用的逃避时间与空白组相差不大（P>0.05）；与普通绿茶组相比，富锌富硒绿茶组所用的逃避潜伏期较短（P<0.01）；与阳性对照组相比，富锌富硒绿茶中剂量组所用的逃避潜伏期与之相当（P>0.05）；与模型组相比，富锌富硒绿茶组所用的逃避潜伏期明显缩短（P<0.01）。在空间探索试验中，与空白组相比，模型组第1次穿越平台区所用时间延长，穿越站台次数明显减少，差异有统计学意义（P<0.01）。普通绿茶组第1次穿越平台区所用时间和穿越站台次数与空白组相差不大（P>0.05）； 与普通绿茶组相比，富锌富硒绿茶组第1次穿越平台区所用时间缩短，穿越站台次数增多，差异有统计学意义（P<0.01）；与阳性对照组相比，富锌富硒绿茶中剂量组第1次穿越平台区所用时间和穿越站台次数与之相差不大（P>0.05）；与模型组相比，富锌富硒绿茶组第1次穿越平台区所用时间缩短，穿越站台次数明显增多（P<0.01）。

3 讨论

富锌富硒绿茶中含有锌和硒2种微量元素。锌元素是生物体内重要的抗氧化酶超氧化物歧化酶的辅基；硒元素是谷胱甘肽过氧化物酶的必需成分，每摩尔GSHPx含有4 g硒原子[7-8]。因此，富锌富硒绿茶可以为机体抗氧化物质提供丰富的原材料。

研究表明，SOD 和GSHPx是机体抗氧化系统中2种重要的抗氧化酶。其中，SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，能够有效清除自由基，减轻脂质过氧化，保护细胞免受损伤。赵会杰等[9]通过D半乳糖所致衰老小鼠饲喂SOD苹果，发现可显著提高小鼠血清和肝脏组织的SOD、CAT和GSHPx活性，抑制脂质过氧化，降低MDA含量。GSHPx则是机体内重要的分解过氧化物的含硒酶。GSHPx的酶活力可以作为衡量机体硒抗氧化的能力[8]。在体内，SOD将超氧自由基O2-转化为H2O2，GSHPx进一步将

H2O2转化为H2O和O2，并且通过减少過氧化物对SOD的损害增加SOD的活性。SOD和GSHPx两者之间明显存在着相互保护作用和协同抗氧化作用[10]。还有研究通过测定SOD活性，推测其改善学习记忆作用可能与其提高体内SOD活性有关[11]，其活力间接反映机体保护细胞免受损伤的抗氧化能力。

研究中，通过皮下注射D半乳糖，在体内代谢过程中产生过量的超氧阴离子自由基O2-和H2O2，引起代谢紊乱，进而提高体内自由基水平及过氧化体内组织制造和自然衰老类似的亚急性衰老模型[12]。同时，以此为模型，研究贵州凤冈富锌富硒绿茶对小鼠的抗氧化作用。通过观察小鼠外观、血清学试验和行为学测试结果，发现造模成功。在小鼠行为学测试中，发现富锌富硒绿茶中剂量组的抗氧化作用最佳，提高小鼠的学习能力，延缓小鼠的衰老。

该试验结果进一步表明，富锌富硒绿茶可明显提高D半乳糖所致衰老小鼠肝脏组织中SOD、GSHPx mRNA和蛋白质表达水平。富锌富硒绿茶可通过改变SOD、GSHPx的mRNA和蛋白质表达，导致小鼠肝脏和血清中SOD、GSHPx含量增加，提高酶活力，在一定程度上增加抗氧化的能力，减慢细胞衰老的速度，达到改善衰老的作用。抗氧化生化指标与水迷宫空间记忆能力试验中定向航行和空间探索试验结果相一致。另外，研究表明，中浓度富锌富硒绿茶剂量抗氧化效果更佳，原因还有待进一步研究。总之，贵州凤冈富锌富硒绿茶具有清除自由基、抗氧化等作用，改善衰老的行为学特征，延缓衰老的进程。

参考文献

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