植物花青素生物合成途径相关基因的研究进展

张云洁 潘怡辰 王汝茜 李集临 张杰

摘要

花青素是自然界中存在的天然色素。通过基因工程等技术手段可以生产出绿色、健康的保健品、水果及观赏性花卉植物。目前与花青素生物合成相关的基因已通过PCR、蛋白质纯化、转座子标签等技术手段从金鱼草、玉米、矮牵牛等植物中分离且克隆。本研究综述了花青素合成途径相关调节基因和结构基因的研究进展。

关键词 花青素;调节基因;结构基因

中图分类号 S188+.1  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2014）34-12014-03

Research Progress of Genes which Relate to the Biosynthetic Pathway of Anthocyanins

ZHANG Yunjie， PAN Yichen， WANG Ruxi， ZHANG Jie* et al

（Harbin Normal University， Harbin， Heilongjiang 150025）

Abstract Anthocyanins are natural pigments， green health care products， fruit and ornamental flowering plants can be produced by such means as genetic engineering technology. Currently， the genes relate to anthocyanins biosynthesis have successfully been isolated and cloned from Antirrhinum majus， Zea mays， Petunia hybrida and other plants through as PCR， protein purification， transposon tagging， etc. Anthocyanin biosynthesisrelated adjustment advances in genetic and structural genes were reviewed.

Key words Anthocyanins; Regulation gene; Structural gene

基金项目 哈师大博士科研启动基金项目（08XBSK87）。

作者简介

张云洁（1988-），女，黑龙江虎林人，硕士研究生，研究方向：分子遗传学。*通讯作者，教授，博士，从事活性蛋白多肽组学研究及分子遗传学方面的研究。

收稿日期 20141027

花青素是植物类黄酮次生代谢途径的产物，是一种天然水溶性色素，以花色苷的形式存在。它使花、果实、种子、根等器官呈红色、蓝色、紫色、蓝紫色等[1]。花青素具有广泛的功能，如吸引昆虫进行花粉传播、防止紫外线损伤、预防病原体攻击、抗寒抗旱等。近期研究表明，花青素有益于人类健康，包括防止癌症、炎症、冠状动脉心脏疾病和其他潜在的与年龄有关的疾病[2]。因此，对于花青素的转录合成途径及其代谢调控的研究具有重要的意义。

1  植物中花青素的合成途径

花青素是类黄酮途径代谢产物，在自然条件下通常与一个或多个鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖等通过糖苷键结合，很少以游离状态存在，一般不影响花色素的呈色反应。

目前，类黄酮途径在拟南芥、矮牵牛、玉米等植物中已较清楚。合成前体是苯丙氨酸，可分为4个阶段。苯丙烷途径是

第一个途径，是大部分次生代谢产物所共有的途径，由苯丙氨酸解氨酶（PAL）调控使其脱去氨基，形成反式肉桂酸[3]，再經肉桂酸4羟化酶（C4H）的作用形成反式4香豆酸。在香豆酸辅酶A连接酶催化下形成香豆酸辅酶A。活化产生的香豆酸可以进一步形成肉桂酸进入木质素途径[4]。第2个阶段由香豆酸与丙二酰辅酶A在查尔酮合酶（CHS）的作用下催化合成4羟基查尔酮，再经查尔酮异构酶（CHI）的催化下形成柚皮素，然后在黄烷酮3羟化酶（F3H）催化下形成二氢黄酮醇。这一阶段出现了如黄酮醇、原花青素苷、异黄酮、鞣红等多个重要的分支途径[4]。第3个阶段在二氢黄铜醇4还原酶（DFR）、花青素合成酶（ANS）和无色花青素双加氧酶（LDOX）的催化下形成各种花青素[5]。第4阶段形成的花青素经过一系列糖基化、酰基化、甲基化的修饰形成稳定的花青素苷，通过转运蛋白运输到液泡中富集和储存[6]（图1）。

2  花青素合成途径的调控基因

目前研究证实，影响花青素合成的调节基因有MYB、MYC（bHLH）、WD40、WRKY、锌脂蛋白、同源域蛋白、MADS蛋白基因家族，其中与花青素合成有直接关系的转录因子主要有MYB蛋白、bHLH蛋白和WD40蛋白3种[7]。这些转录因子与真核基因的顺式作用元件特异性结合，激活或抑制花青素合成途径中多个基因的表达，从而调控花青素的生物合成途径。

植物中的MYB蛋白属于DNA结合蛋白，含有一段保守的结合区域，即MYB结构域。目前，已从玉米、金鱼草、水稻、矮牵牛、葡萄、拟南芥、非洲菊、苹果、番薯、石竹目、草莓、小麦等中克隆鉴定出[8]。一般每个MYB区域含有51～53个氨基酸，每个MYB区折叠成螺旋-转角-螺旋的形式与DNA的大沟结合。植物中的MYB转录因子可根据所含有的MYB结构域数目分为3种。一类是只含有一个MYB结构的MYB蛋白。研究表明，它是一类重要的端粒结合蛋白，对于维持染色体结构稳定、完整及转录调节有重要作用。第2类是含有2个MYB结构域的R2R3MYB转录因子。它们参与植物次生代谢、细胞分化、抗逆胁迫、激素应答等多方面的调控。第3类是含有3个结构域的R1R2R3MYB，与真菌和动物中的MYB蛋白高度同源，参与细胞分化和细胞周期的调控[9]。

另一类转录因子是bHLH蛋白，广泛地存在于各种生物中，从简单的酵母菌到复杂的多细胞生物，如人类。研究表明，bHLH蛋白参与调控多数物种的细胞增殖作用及多个分化途径。在植物中bHLH蛋白具有广泛的功能，如参与调控表皮细胞的分化、花器官的发育调节、激素应答、类黄酮生物合成等[10]。在拟南芥中已分离、鉴定出133个bHLH基因，最初被划分为12个亚类[11]。进一步研究从拟南芥、杨树、苔藓及藻类中分离了638个bHLH基因家族，使原来的系统进化树延伸为32个亚类[12]。

目前WD40蛋白在许多真核细胞生命进程中被看作为重要的调节因子，包括细胞分裂、囊泡的形成和转运、信号转导、RNA加工修饰。这些蛋白质通常由44～60个氨基酸组成的肽基序，通常由GH二肽（甘氨酸-色氨酸）在N末端和WD二肽（色氨酸-天冬氨酸）在C末端[13]。值得注意的是，WD40通过参与组蛋白修饰的染色质构型重塑，影响转录过程[14]。MYB和bHLH结构蛋白之间的相互作用已被广泛研究，一直是最近10年研究的焦点，特别是类黄酮生物合成途径[15]。WD40蛋白被认为不具有任何催化活性，而似乎是一个对接平台在调节花青素和PA的生物合成途径。例如，在拟南芥中，TTG1主要通过与 bHLH合作调控TT2TT8TTG1的表达[16]。

图1 花青素、黄酮醇和原花青素等类黄酮物质生物合成途径[4]

3  花青素合成途径的结构基因

在花青素生物合成中主要的酶基因有苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）、查尔酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）、查尔酮异构酶（Chalcone isomerase，CHI）、二羟基黄酮醇还原酶（Dihydroflavonol 4reductase，DFR）、黄烷酮3羟化酶（Flavanone 3hydroxylase，F3H）、花色素苷合成酶（Anthocyanin synthase，ANS） 以及类黄酮3O糖基转移酶（ flavonoid 3Oglucosyltransferase，UFGT）。目前，通过PCR、转座子标签法及蛋白质纯化等方法已从玉米、矮牵牛、苹果、金鱼草、草莓等植物中分离、克隆出花青素合成相关酶基因。

苯丙氨酸解氨酶催化L苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸，是植物花青素类黄酮合成途径中的第一个酶。它存在于所有绿色植物中，在藻类、真菌、细菌中也有发现。研究表明，不同植物中PAL活性不同。在一株植物中，不同的组织部位活性也不同，一般越嫩的部位PAL活性越高。PAL基因由4个亚基组成，有多个基因家族编码，在这个家族中不同成员的表达具有特异性[17]。目前，已从多数植物组织中分离、纯化出PAL，不同来源的PAL结构、分子量等均不相同，但总体来说分子量为240～330 kD，一般可解离成55～85 kD的亚基。苯丙氨酸解氨酶是由4个相同亚基构成的四聚体。PAL没有固定的Km值，一般在10-2～10-4之间，其活性中心部位含有脱氢丙氨酰基的亲电中心[18]。

查尔酮合酶基因目前已从多数植物中克隆得到，如拟南芥、苜蓿、水稻、小麦、玉米等[19]。研究表明，CHS在多数植物中存在多个拷贝，尤其是在双子叶植物中，如大豆、矮牵牛等;但是在小麦、玉米、大麦等单子叶植物中一般只含有2个CHS基因。除金鱼草外，CHS在不同植物中的保守性较高，一般含有2个外显子和1个内含子，其中外显子1编码约60个左右的氨基酸残基，而外显子2编码约340个左右氨基酸残基，内含子的差异相对较大[20]。

查尔酮异构酶基因最早是通过抗体技术从法国豌豆中分离出来的[21]，之后陆续从矮牵牛、玉米、豌豆、苜蓿、翠菊和水蓮等植物中分离克隆出。CHI按作用底物不同可以分为两类，一类存在于豆科植物中，另一类存在于非豆科植物中。还有研究表明，CHI除在植物中普遍存在外，在真菌、黏土霉菌中都存在植物CHI直系同源类的蛋白，但是缺乏上游的查尔酮合酶（CHS）。研究表明，CHI基因结构上变化很大，不同类型的CHI基因即使在同一物种中差异也比较大，同源性一般为42%～65%[22]。

二羟基黄酮醇4还原酶（DFR）是催化二氢栎皮黄酮（DHQ）生成无色花青素、二氢杨梅黄酮（DHM）生成无色花翠素、二氢堪非醇（DHK）生成无色花葵素的关键酶[5]。DFR基因最早从玉米、矮牵牛和金鱼草中分离出来，后续从拟南芥、水稻、马铃薯、苹果、小麦等中克隆出来[23]。在不同的物种中，DFR氨基酸序列有较高的同源性，与NADPH的结合位点也是保守的。不同物种的DFR基因在不同的部位和不同的发育期的表达特性也存在差异[5]。

黄烷酮3羟化酶是植物类黄酮类化合物代谢途径的关键酶，是依赖型2酮戊二酸的双加氧酶（2ODD）的家族成员，需要抗坏血酸、分子氧、2酮戊二酸和铁参与代谢反应，催化柚皮素C3位羟基化，生成二氢山奈素（DHK）[5]。DHK则是异黄酮、黄铜合成的重要代谢中间产物。F3H基因最早从金鱼草中被克隆分离出，已在许多植物中被分离克隆到，如银杏、苹果、小麦、紫花苜蓿和玉米等。鉴于柚皮素作为F3H的作用底物，F3H参与黄酮和花青素苷产物合成的调控，是整个黄酮类化合物代谢途径的关键位点[24]。

花青素合成酶基因最早是从玉米突变体中利用转座子标签法分离得到的。研究表明，ANS蛋白属于2酮戊二酸双加氧酶家族，与类黄酮合成途径中其他同属此家族的黄酮醇合成酶具有保守的同源关系[25]。

类黄酮3O糖基转移酶和花青素合成酶都是花青素苷生物合成途径后期起关键作用的酶，通过与液泡、细胞质的共同作用使花青素转变为稳定状态的花色苷。UFGT基因目前在紫苏、花生、马鞭草等植物中已有所报道。研究表明，在苹果、草莓和荔枝中花青素苷积累与UFGT活性呈明显的正相关[26]。

4  展望

近些年对有关花青素生物合成相关的结构基因和调节基因的研究取得很大的进步，如合成后期酶的修饰、运输、沉积等方面的研究都为进一步揭示花青素生物合成途径奠定了基础。分子生物学、酶工程的发展及基因工程的应用可以进一步分离、鉴定出转录因子，有效地调控植物花色素的积累，开发出有益于人类健康的富含花青素的保健品。

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