广东道地药材何首乌HPLC指纹图谱研究*

焦豪妍 ，王 英 ，陈丽莉 ，汤庆发

（1.广东食品药品职业学院中药研究所，广东 广州 510520； 2.暨南大学中药及天然药物研究所，广东 广州 510632； 3.南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515）

何首乌又称首乌、赤首乌，为蓼科植物何首乌 Radix Polygonum multiflori的干燥块根，具有解毒、消痈、截疟、润肠通便的功效，常用于治疗瘰疬疮痈、风疹瘙痒、久疟体虚、肠燥便秘等[1]。其化学成分主要有羟基蒽醌类化合物（主要为大黄素、大黄酚、大黄酸等葡萄糖苷），醌类化合物，二苯乙烯苷类化合物，酰胺类化合物，色原酮类化合物，卵磷脂，微量元素钙、铁、锌、锰、铜等[2－7]。药理学研究表明，何首乌久服能延年不老；能入血分，消痰毒；能止心痛，益血气；能调气血、肝风；能专入肾，益精髓；能补肝肾，入肝肾脾经；何首乌功效中之乌发相关的药理作用研究有待进一步深入[8－14]。何首乌主产于广东、河南、山东、广西等多个省区，其中广东德庆产何首乌种植历史悠久、品质优，是何首乌的道地品种。本试验中建立了何首乌药材的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，对13批样品进行了相似度评价，并对7个主要成分进行了化学指认，采用SPSS软件通过聚类分析将样品聚为Ⅱ类，为何首乌药材的质量评价和综合利用提供了科学依据。

1 仪器与试药

Agilent 1260型高效液相色谱仪系统(包括四元泵、真空在线脱气机、自动进样器、柱温箱、VWD检测器及Agilent色谱工作站)；KQ3200E型超声波清洗器(昆山超声波仪器有限公司)；Sartorius BP211D型十万分之一电子分析天平；Jinteng Science溶剂过滤器；四两装高速中药粉碎机(瑞安市永历制药机械有限公司)；相似度评价软件(中国药典会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件2004A版》)。甲醇、乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯；水为去离子水；何首乌药材购自德庆市道地产区，产地为德庆市余家巷村，经暨南大学中药及天然药物研究所周光雄教授鉴定，为蓼科植物何首乌的干燥块根。13批次何首乌药材来源见表1。对照品包括没食子酸、表儿茶素、2，3，5，4′－四羟基顺式二苯乙烯 －2－O －β－D －葡萄糖苷、2，3，5，4′－四羟基反式二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷、决明酮－8－O－β－D－葡萄糖苷、大黄素 －8－O－β－D－葡萄糖苷、大黄素，均由本实验室分离获得，采用UV，MS，1H及13C NMR等光谱方法确定其结构。

表1 何首乌药材来源

2 方法与结果

2.1 溶液制备

精密称取各对照品适量，置5 mL容量瓶中，加50%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。取何首乌干燥药材粉碎，过60目筛，精密称取粉末2.0 g，置100 mL锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液25 mL，精密称定质量，超声提取60 min(250 W，40 kHz)，温度40℃。放置至室温后，精密称定质量，以50%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，经微孔滤膜(0.45 μm)过滤，即得供试品溶液。

2.2 方法学考察

2.2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：XtimateTMC18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A相）－0.1%甲酸水溶液（B相），梯度洗脱程序，B相0～5 min（15% ～15% ），5～30 min（15% ～40% ），30～45 min（40% ～65% ），45～60 min（65% ～100% ）；流速：1.0 mL /min；柱温：25 ℃ ；检测波长：270 nm；进样量：10 μL。所有色谱峰均达到基线分离，且在60 min内完成检测，理论板数按大黄素峰计算应不低于6 000。

2.2.2 精密度试验

取2.1项下对照品溶液，连续进样6次，记录指纹图谱。结果相似度均大于0.9，共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明方法仪器精密度良好。

2.2.3 重复性试验

按2.1项下方法平行制备6份供试品溶液，分别进样，记录指纹图谱。结果相似度值均大于0.9，共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积 RSD小于3.0%，表明方法重复性良好。

2.2.4 稳定性试验

取 2.1 项下供试品溶液，分别于 0，2，4，8，12，24 h 时进样，检测指纹图谱，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版软件计算相似度。结果均大于0.9，各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值无明显变化，RSD值均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3 相似度计算

运用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)》对13批何首乌药材的指纹图谱进行相似度分析，通过中位数矢量计算得出何首乌样品指纹图谱的共有模式进行整体相似度评价。

2.4 指纹图谱分析及评价

共有模式指纹图谱的建立：取13批何首乌样品，以2.1项下方法分别制备成供试品溶液，采用拟订的HPLC色谱条件进行测试，记录各自的色谱图(图1)。将13批何首乌药材样品指纹图谱的AIA数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A2.0版》软件进行分析，时间窗0.1，中位数法，以11号峰(大黄素)为参照峰，经多点校正后自动匹配后生成何首乌药材的对照指纹图谱，并确定了11个共有峰，何首乌药材对照指纹图谱(共有模式)见图 2。

图1 13批何首乌药材样品的HPLC指纹图谱

图2 何首乌药材对照指纹图谱(共有模式)

相似度评价：将13批何首乌药材样品指纹图谱的AIA数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)》软件，计算各样品指纹图谱与生成的对照图谱 R的相似度。结果见表2。可见，除第8批药材样品相似度稍差外，其他批次样品与对照指纹图谱的相似度在0.924～0.994之间。

表2 何首乌药材相似度计算结果

相对保留时间和相对峰面积：为更好地说明相似度结果，选择13批何首乌药材样品的指纹图谱其中5个明显的共有峰，其保留时间依次为 13.34，17.10，33.75，36.10，47.16 min。以 11 号峰(大黄素)为参照峰，统计相对保留时间和相对峰面积的 RSD。结果显示，13批供试品指纹图谱主要共有峰的相对保留时间的RSD均小于 1.0%，但相对峰面积的 RSD差异较大，在 0～96.91%之间，说明各批次何首乌药材样品整体具有一定的相似性，但部分色谱峰所代表的化学成分含量有较大差异。

2.5 聚类分析

系统聚类分析是一种无管理、无指导的模式识别方法，根据所测样品的色谱指纹图谱特征，对样品进行分类。应用SPSS 130软件，采用分层聚类分析方法以欧式距离作为样本间的相似性测定，采用组间联结法 (between－groups linkage)测度。聚类分析结果见图3。当聚合距离为25时，13批样品大体上聚为Ⅱ类，样本9，10，11，12，13为第 1类，其余样本为第 2类。结合色谱图观察，此分类情况与样本来源情况和相似度结果吻合。

图3 13批样本聚类分析结果

2.6 主要色谱峰的化学指认

取何首乌药材样品(第7批)，按2.1项下方法制备供试品溶液；取本课题组从何首乌中分离得到的7个化学对照品适量，按2.1项下方法制备对照品溶液；以 2.2项下色谱条件分别进行检测。对比7个对照品的色谱保留行为，何首乌药材样品HPLC指纹图谱中 1，2，4，5，7，8，11 号峰得到了明确的化学指认。结果见图4。可见，所指认的色谱峰占总峰面积80%，占共有峰面积的90%。

图4 何首乌HPLC指纹图谱及7个主要色谱峰对照品的HPLC图谱叠加图

3 讨论

本研究中在提取、测试条件等方面经过大量试验摸索，建立了13批不同来源广东道地药材何首乌的HPLC指纹图谱。结果表明，13批何首乌药材对照图谱中主要色谱峰的整体图貌基本一致，与对照图谱的相似度均较好，但何首乌样品中主成分的色谱峰峰面积均相差较大，推测是由于采摘季节和生长环境的影响，导致批次样品的各化学成分含量不一。另外，采用SPSS软件对13批药材进行了聚类分析，依据指纹特征，将药材聚为Ⅱ类。

与以往何首乌指纹图谱的研究[15－20]不同，本研究中在对何首乌的化学成分进行深入研究的基础上，前期分离和鉴定了其主要有效成分，除了形成良好的指纹图谱，还采用课题组分离得到的标准品指认了7个主要有效成分，确定了其化合物结构，所指认的色谱峰占总峰面积80%。该指纹图谱简便、稳定、可靠、重复性好，对鉴别药材的真伪优劣有一定的参考价值。

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