厚朴四君子汤颗粒的HPLC指纹图谱及其与组方药材的相关性研究

杨小秋，罗文汇，董玉娟，彭丽诗,许灿新

(1.深圳市南山区西丽人民医院，广东 深圳 518055；2.广东省中医药工程技术研究院，广东 广州 510095；3.广州中医药大学，广东 广州 510405)



厚朴四君子汤颗粒的HPLC指纹图谱及其与组方药材的相关性研究

杨小秋1，罗文汇2*，董玉娟3，彭丽诗3,许灿新3

(1.深圳市南山区西丽人民医院，广东 深圳 518055；2.广东省中医药工程技术研究院，广东 广州 510095；3.广州中医药大学，广东 广州 510405)

目的：建立厚朴四君子汤颗粒的指纹图谱，为该制剂的质量控制提供实验基础。方法：采用高效液相色谱法，以SHISEIDO Capcell park MC C18(4.6mm×250mm，5μm) 为色谱柱；以甲醇 (A)-0.1%(体积分数)磷酸(B)为流动相进行梯度洗脱；检测波长240nm；流速1.0mL·min-1；柱温30℃,建立厚朴四君子汤颗粒的HPLC指纹图谱共有模式，并对色谱峰进行归属分析。结果：确定了24个共有峰，10批样品相似度均在0.9以上，其中20个色谱峰分别溯源到厚朴、人参、白术、茯苓和甘草五味药材，4个色谱峰可明确化学成分的归属。结论：该实验建立的HPLC指纹图谱体现了厚朴四君子汤颗粒的整体特征，能有效地对其质量进行评价。

厚朴四君子汤颗粒；指纹图谱；高效液相色谱

厚朴四君子汤由厚朴加四君子汤组成。“四君子汤”为《太平惠民和剂局方》的经典方，由人参、茯苓、白术、甘草组成，具有补气、健脾、利湿之功效，是中医治疗脾胃气虚、运化无力的常用方剂，现代医学常用于慢性胃炎、胃及十二指肠球部溃疡等属脾胃气虚型疾病的治疗[1]。根据临床常见慢性胃炎患者大多有食积气滞、脘腹胀闷或腹痛、泄泻等的症状，在“四君子汤”的基础上加具有行气化湿、温中止痛的厚朴，称之为“厚朴四君子汤”。厚朴四君子汤颗粒具有行气化湿止痛、益气健脾之功效，现代临床多用于治疗慢性胃炎、胃及十二指肠球部溃疡等属脾胃气滞、气虚证。

本研究在前期探讨了厚朴四君子汤治疗慢性胃炎的药效作用[2]，为了更好地控制厚朴四君子汤颗粒的质量，采用高效液相色谱法构建厚朴四君子汤及各单味药指纹图谱，并对组方药材与颗粒之间的相关性进行研究，同时对色谱峰进行归属，以期为厚朴四君子汤的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695-2998型高效液相色谱仪(美国沃特斯公司，PAD检测器，四元梯度泵)，软件为Empower 2 数据处理软件系统；SHISEIDO Capcell park MC C18(4.6 mm×250 mm，5μm) 色谱柱；KQ5200DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Mettler XS205DU 电子天平(瑞士梅特勒托利多公司)；MilliPoreAdvantage A10 自动纯水机(美国默克密理博公司)。

1.2 试药

厚朴四君子汤颗粒由深圳市南山区西丽人民医院提供，批号见表1。厚朴、人参、茯苓、白术、甘草药材均购于安徽广印堂制药有限公司，经刘法锦研究员鉴定：厚朴为木兰科植物厚朴MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮；人参为五加科植物人参PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根和根茎；白术为菊科植物白术AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根茎；茯苓为多孔菌科茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf的干燥菌核；甘草为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根茎。甘草苷对照品(批号：111610-201005)、甘草酸铵(批号：110731-200615)、厚朴酚(批号：729-9204)、和厚朴酚(批号：730-9204)均购于中国食品药品检定研究院。

甲醇、乙腈为色谱纯(美国默克公司)；液相用水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

表1 厚朴四君子汤颗粒测试样品批号

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：SHISEIDO Capcell park MC C18(4.6mm×250mm，5μm) ；流动相：以甲醇为流动相A，0.1%(体积分数)磷酸的水溶液为流动相B，按表2程序，进样测定。检测波长：240nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃。

表2 流动相梯度洗脱条件

2.2 对照品溶液制备

分别精密称取甘草苷、甘草酸铵、厚朴酚和和厚朴酚对照品适量，置100mL容量瓶中，加甲醇分别制成每1mL含甘草苷0.101mg、甘草酸铵0.1664mg、厚朴酚0.5378mg和和厚朴酚0.6012mg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备

分别取上述S1～S10厚朴四君子汤颗粒各约2.0g，精密称定，置100mL具塞锥瓶中，精密加入50%甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)30min。取出，放冷，再称定重量，加50%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 厚朴四君子汤颗粒组方药材供试品溶液制备

分别取与颗粒投料同批药材，厚朴药材粉末1.5g、人参药材粉末3.0g、白术药材粉末2.0g、茯苓药材粉末5.0g、甘草0.5g，精密称定，加水100mL，煮沸30min，蒸干，加硅藻土1.0g拌匀，同“2.3”项方法制成厚朴四君子汤颗粒组方药材供试品溶液。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 取同一批厚朴四君子汤颗粒(批号：J130805)，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，按“2.1”项下条件测定。以9号峰为参照峰，其保留时间和峰面积为1，计算出各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果其RSD值均小于3%，同时用相似度评价软件计算各指纹图谱的相似度均大于0.99，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验 取同一批厚朴四君子汤颗粒(批号：J130805)，分别精密称取6份，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件测定。以9号峰为参照峰，其保留时间和峰面积为1，计算出各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3%，同时用相似度评价软件计算各指纹图谱的相似度均大于0.99，表明本方法重复性良好。

2.5.3 稳定性试验 取同一批厚朴四君子汤颗粒(批号：J130805)，分别于制备后0、4、8、12、16、24h进样，按“2.1”项下条件测定。以9号峰为参照峰，计算出各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3%，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.6 厚朴四君子汤颗粒HPLC指纹图谱的建立

2.6.1 厚朴四君子汤颗粒对照指纹图谱的建立及特征峰的指认 采用药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)对10批厚朴四君子汤颗粒HPLC图谱进行处理，匹配结果见图1，所得对照指纹图谱见图2。选择稳定性好、吸收较强、特征明显的色谱峰为共有峰，根据10批样品的测定结果确定24个共有峰。经与对照品溶液色谱图比对后，确认样品图谱中10号峰为甘草苷、22号峰为甘草酸铵、23号峰为和厚朴酚和24号峰为厚朴酚。9号峰峰面积大小适中，基线分离，以9号峰为参照峰，其保留时间和峰面积为1，各共有峰的相对保留时间及相对峰面积分别列于表3、表4。10批厚朴四君子汤颗粒与对照指纹图谱相似度分别为：0.981、0.973、0.980、0.962、0.973、0.984、0.986、0.975、0.901、0.991。各批厚朴四君子汤颗粒与对照指纹图谱的相似度均较高，为了保证厚朴四君子汤颗粒的质量，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)计算，应规定供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90。

图1 10批厚朴四君子汤颗粒色谱匹配图谱

图2 厚朴四君子汤颗粒的HPLC图谱

注：A对照指纹图谱，B对照品色谱；10甘草苷、22甘草酸铵、23和厚朴酚、24厚朴酚

表3 10批厚朴四君子汤颗粒指纹图谱共有峰的相对保留时间

续表3 10批厚朴四君子汤颗粒指纹图谱共有峰的相对保留时间

表4 10批厚朴四君子汤颗粒指纹图谱共有峰的相对峰面积

2.6.2 复方与药材相关性研究 采用相同色谱条件测定各药材及复方指纹图谱，通过各色谱峰保留时间的比较分析，归属了 20个特征峰，其中5、6、7、8、9、18、19、23、24号峰来源于厚朴，10、11、12、14、15、16、21、22号峰来源于甘草，1、19号峰来源于厚朴和白术，2、4号峰来源于人参和茯苓，见图4。3、13、17、20号峰不属于任何单味药，推断其为厚朴四君子汤经水煎煮过程中的化合产物。

3 讨论

考察不同流动相体系、检测波长和供试品溶液的制备方法，结果显示以甲醇-0.1%磷酸为流动相体系梯度洗脱所得到的色谱图基线较平稳且分离效果好；检测波长在240nm测定，特征峰数多且响应灵敏度高；以50%甲醇超声30min，所得色谱图最大限度地反映了颗粒的特征。

图4 厚朴四君子汤与其各单味药HPLC指纹图谱

注：A厚朴四君子汤颗粒；B厚朴药材;C人参药材;D白术药材;E茯苓药材；F甘草药材

中药复方制剂的多指标定量分析是目前质量控制和评价的一个技术难点，其根本原因在于可供定量用的对照品有限[3]。中药指纹图谱是一种综合性、可量化的鉴定手段，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性，为中药复方物质基础研究提供方法学平台。建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价，这也正好符合中医理论的整体学说。[4]

本研究建立了厚朴四君子汤颗粒的HPLC指纹图谱，此方法简便、可靠、重现性好，为后续厚朴四君子汤颗粒药效物质基础研究的深入开展奠定了基础。以9号峰为参照峰确定了厚朴四君子汤颗粒的24个共有峰，并通过相似度计算软件得到10批厚朴四君子汤颗粒的对照指纹图谱及各批样品与对照指纹图谱之间的相似度，结果10批样品相似度均在0.9以上。不同批号厚朴四君子汤颗粒指纹图谱的色谱峰整体上基本一致，表明厚朴四君子汤颗粒提取工艺及制剂工艺都比较稳定，对原料药材的质量控制良好，保证了厚朴四君子汤颗粒质量的稳定性和一致性，可以满足生产的需要。本文所建立的HPLC指纹图谱可有效控制厚朴四君子汤颗粒的质量，同时研究结果显示，厚朴四君子汤合煎后产生了各单味药独立水煎所不具有的新成分，提示复方水煎液所含药物化学成分不等同于各单味药药物化学成分的简单加合，从药物化学的层面，再次验证了“药有个性之所长，方有合群之妙用”的古训[5]。

[1] 高永珍,武瑞珍,陈永利.四君子汤在中医内科疾病脾胃气虚证中的应用[J].中国民族民间医药,2013(05):52.

[2] 曾国庆,杨小秋,付英玉.厚朴四君子汤治疗慢性胃炎疗效观察[J].中国实用医药,2012,7(34):128-129.

[3] 罗文,刘斌,王伟,等.基于降脂宁调脂抗氧化有效部位HPLC指纹图谱的多指标成分定量方法研究[J].北京中医药大学学报,2010,33(6):413.

[4] 孙响波,于妮娜,张法荣.黑地黄丸及其各单味药HPLC指纹图谱研究[J].辽宁中医药大学学报,2014,1(16):64-65.

[5] 孙志翠,裴强伟,王欣，等.酸枣仁汤及其各单味药HPLC 指纹图谱研究[J].辽宁中医杂志,2013,40(5):988-989.

(责任编辑：魏 晓)

HPLC Fingerprint of Houpo Sijun Decoction Granules and Correlativity with Its Relevant Herbs

Yang Xiaoqiu1,Luo Wenhui2,Dong Yujuan3,Peng Lishi3,Xu Cangxin3

(1. Nanshan District Xili People's Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518055, China; 2.Guangdong Province Engineering Technology Research Institute of Chinese Medicine, Guangzhou 510095, China; 3.Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China)

Objective:To establish the HPLC fingerprint of traditional Chinese medicines Houpo Sijun Decoction Granules and provide experimental basis for the quality control.Methods:The analytical column was SHISEIDO Capcell park MC C18(4.6mm×250mm，5μm).Gradient elution was used with mobile phase consisting of methanol-0.1% phosphoric. The detective wavelength was set at 240nm. The flow rate was 1.0 mL·min-1and the column temperature was maintained at 30℃. Establish the characteristic mode of HPLC fingerprint and the correlativity between fingerprint peaks of Houpo Sijun Decoction Granules and its component herbs was analyzed．Results:The HPLC fingerprint consisted of 24 common peaks，among which 20 peaks were assigned by parallel comparison with the fingerprints of Magnolia officinalis，Panax ginseng，Atractylodes macrocephala, Poria cocos,and Glycyrrhiza uralensis,and 4 peaks were identified by comparison with the chemical reference substances.Conclusion:The established HPLC fingerprint reflects the general character of Houpo Sijun Decoction Granules. It can be used as a quality control method for Houpo Sijun Decoction Granules.

Houpo Sijun Decoction Granules; Fingerprint; HPLC

2014-03-21

广东省中医药局科研项目(20121044)

杨小秋(1963-), 男，广东省深圳市南山区西丽人民医院副主任中药师,研究方向中药学。

罗文汇(1980-)，男，广东省中医药工程技术研究院副主任中药师,研究方向为中药质量评价。

R284.1

A

1673-2197(2014)13-0014-05