乙型肝炎病毒的基因分型及其多药耐药位点变异与耐药性的相关性研究*

张 宝 ，李世龙 ，葛保民 ，秦 莉 ，田珊红 ，周秀艳 ，李 霞

（1.河北省唐山市传染病医院，河北 唐山 063000； 2.河北省唐山市人民医院，河北 唐山 063000；3.河北省唐山市工人医院，河北 唐山 063000）

目前，大多数乙型肝炎病毒（HBV）基因型研究的重点是A－F基因型。HBV的P区可编码DNA复制所需的末端蛋白，而且参与了病毒复制的全过程，始于约2500 bp，C区与开始区段重叠，中间区段与S区重叠，最后片段与X区重叠。研究认为，HBV对核苷类似药物耐药性的产生与HBV P基因多位点的变异有关。本研究中采用毛细管电泳直接测序技术检测了HBV基因型A－F及HBV P 区的 rtV173L，rtL180M，rtA181V ／T ／S，rtT184A ／G ／I／S，rtS202G ／I，rtM204V ／I，rtV207I／L ／G，rtS213T，rtV214A，rtQ215S，rtN236T，rtP237H，rtN238T ／D，rtM250V ／I位点突变情况并进行分析。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 样本来源、试剂及仪器

样本为2010年至2012年河北省唐山市传染病医院门诊和住院部239例需要抗病毒治疗的慢性乙型病毒性肝炎患者。其中男195例，年龄18～77岁，平均44.48岁；女44例，年龄20～63岁，平均 41.29岁；HBV－DNA均呈阳性，且 HBV－DNA≥104拷贝／mL；诊断符合《乙型肝炎防治指南》中的诊断标准。HBV及耐药突变检测试剂盒（核酸扩增荧光定量及测序法），购自上海申友生物技术有限责任公司。ABI 310型系列PCR荧光检测仪；Sequencing Analysis5.2软件。

1.2 方法

采用核酸扩增技术结合荧光标记探针杂交方法，对HBV－DNA进行定量检测。对定量检测HBV－DNA≥5×103拷贝／mL的样本，取其PCR产物3μL，再加入2μL虾碱性磷酸酶（SAP）的混合物，混匀，37℃ 60 min，80℃ 15 min，最后于 4℃保存。取阳性PCR酶解产物3μL、测序试剂（bigdye）1μL和测序产物2μL进行PCR扩增，DNA测序产物经一系列步骤纯化后上机电泳，在自动化的ABI310型基因分析仪上进行测序。

1.3 统计学处理

收集整理原始数据录入计算机，采用SPSS 17.0统计软件进行处理。

2 结果

在使用抗病毒药物的239例患者中，利用毛细管电泳法检测到B基因型HBV感染者30例（12.55%），C基因型HBV感染者203例（84.94%）；D基因型 HBV感染者 1例（0.42% ），5例（20.%）HBV感染者低于最低检测限。可见，本组患者HBV基因型主要是C型和B型，这一结果与谢秀琴等［1］的研究结果相似。D基因型是在我国北方地区较少发现的基因型。但本研究中未检出B和C混合型的基因型，这可能与病例数少或存在地区性差异有关，有待进一步跟踪。239例患者HBV耐药性情况见表1。

3 讨论

目前全球约1／3的人曾感染过HBV，其中有3.6亿人发展为慢性乙型病毒性肝炎，我国约有慢性HBV感染者1.3亿人，且每年死于HBV持续感染相关疾病［2］，包括肝细胞癌（HCC）的至少有100万人，最值得关注的是慢性HBV持续感染会发展为肝硬化、肝癌，严重威胁着人类的健康。国内外公认的抗HBV药物主要有干扰素和核苷（酸）类似物两大类，常用的核苷（酸）类似药物有拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定和恩替卡韦等，它们通过抑制HBV复制而在治疗过程中促使乙型肝炎e抗原（HBeAg）的血清学转换，并最终清除病毒，从而控制病情的进展。对于慢性抗HBV感染者，HBV治疗需要长期用药，通常情况下至少需要2年，若未经专科医生同意，在病情缓解不稳固的情况下停药，不仅不能抑制病毒，还可能加速病毒耐药的发生，甚至使病毒的复制反弹，导致病情加重。临床研究表明，拉米夫定治疗1，2，3，4年的基因耐药率分别为14%，38%，49%，66%；阿德福韦酯治疗1，2，3，4，5年的基因耐药率为0，3%，11%，18%，29%；在拉米夫定治疗失败的患者中，恩替卡韦治疗1，2，3年的基因耐药率为6%，14%，32%，其中伴有病毒反弹的临床耐药率分别为1%，10%，25%［3－4］。因此，在用药过程中及时检测病毒耐药情况，有利于临床及时调整用药方案，控制病情进一步发展。

表1 239例患者血清样本HBV耐药情况

HBV有较高的突变率和复制率，高度易突变性体现在，其DNA多聚酶在DNA复制过程的逆转录环节缺失校正活性，且HBV的各个基因区及多数调控元件都可能发生变异。另外，某些位点的变异可影响多个基因片段，原因就在于HBV基因存在基因重叠，变异病毒株可改变免疫原性和致病性，引起宿主免疫应答的相应变化，导致病情加重并趋复杂化，甚至恶性化成重症肝炎；而且在长期HBV感染过程中HBV发生变异，会引起病毒DNA与宿主DNA发生整合，诱导肝癌的发生。

有文献报道，拉米夫定变异的多为YMDD花式区域的rtM204V／I，而本研究检测出拉米夫定主要的变异除rtM204V／I外，还有 rtL180M 变异及 rtV173L变异和 rtV207I／L／G，rtS213T变异，与 Aye 等［5］和 Hussain 等［6］的报道有一致性，大大提高了耐药检出率。这也提示rtV173L突变伴随M180＋M204出现可能与拉米夫定耐药相关，验证了William等［7］的报道。本研究中共检出对拉米夫定耐药的患者101例，占42.26%，其中8例拉米夫定耐药血清中同时有3例对替比夫定耐药，为单独rtM204I／V／S变异所致；检出对阿德福韦酯耐药43例，占17.99%，耐药率明显低于拉米夫定，主要是 rtN236T，rtA181V ／I／S，rtN ／H238T ／D位点变异，并有1例rtV214A变异，1例rtN236T野生和突变共存株，1例rtQ215S野生和突变共存株，2例rtP237H野生和突变共存株；目前发现的恩替卡韦耐药突变大多发生于拉米夫定耐药的患者，主要由 rtM250V ／L，rtT184A ／G ／I／S，rtS202G ／I结合rtM204I／V／S＋rtL180M突变组成。另外，随着抗病毒药物的长期应用，有35.56%的患者出现了拉米夫定、替比夫定和恩替卡韦共同耐药，甚至已有3.35%的患者出现了拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定和恩替卡韦4种抗病毒药共同耐药的情况，这明显加大了治疗难度。

HBV各基因型之间存在着致病性和治疗应答方面的差异。可能与C基因型预后不良有关的是：B和C基因型之间的差异性体现在慢性乙型病毒性肝炎B＋C及C基因型患者经拉米夫定治疗后HBV－DNA阴转率、HBeAg血清转换率及ALT复常率均显著高于B型慢性乙型病毒性肝炎患者［8］，并且C基因型与炎症坏死及肝纤维化的关系更为密切，更易引起更严重的肝脏疾病如肝硬化和肝细胞癌；在年龄大于30岁的感染者中，尤为明显的是Ba亚型患者的HBeAg阳性率显著高于Bj亚型，后者发生肝细胞癌的年龄显著高于前者。对于拉米夫定耐药变异的慢性乙型病毒性肝炎患者，YIDD变异主要发生于C基因型，B基因型多发生YVDD变异，且变异后的B基因型的HBV复制水平比C基因型要低，B基因型、C基因型拉米夫定耐药的HBV病毒学分析对于患者的临床用药具有明确的指导价值。研究显示，拉米夫定与阿德福韦酯联合用药对拉米夫定耐药特别是基因B型HBV更有效［9］，但应考虑长期用药会产生耐药性的风险［10］。本研究中利用毛细管电泳法检测HBV，基因分型和耐药位点，可指导临床抗病毒药物的正确选择，可以提早2～3个月检测到耐药位点的变异情况。因此，适时进行基因耐药的检测，可以预防“病毒学突破”的发生，先于临床发现耐药现象，可及时指导临床选择抗病毒药物，从而避免人力、物力、财力的极大浪费，提高抗病毒药物的疗效，在一定程度延缓患者由慢性乙型病毒性肝炎发展为肝硬化、肝癌。

参考文献：

［1］谢秀琴，许家璋，李 平，等.江苏地区乙型肝炎病毒基因分型及其临床意义［J］. 疾病控制杂志，2005，9（2）：171 －173.

［2］ Maynard JE.Hepatitis B：global importance and need for control［J］.Vaccine，1990，8（Suppl）：S18 － S20.

［3］Liaw YF，Leung NW，Chang TT，etal.Effectsofextended lamivudine therapy in Asian Patients with chronic hepatitis B.Asia Hepatitis B Lamivudine Study Group［J］.Gastroenterology，2000，119（1）：172 － 180.

［4］ Hadziyannis S，Tassopoulos NC，Chang TT，et al.Longterm adefovir－ dipivoxil treatment induces regression of liver fibrosis in patients with HBeAg － negative chronic hepatitis B：results after 5 years of therapy［J］.Hepatology，2005，42（Suppl1）：754A.

［5］Aye TT，Barthelomeusz A，Shaw T，etal.Hepatitis B virus polymersemutations during antiviral therapy in a patient following liver transp lantation［J］.Hepatol，1997，26（5）：1148 － 1153.

［6］Hussain M，Lok AS.Mutations in the hepatitis B virus polymerase gene associated with antiviral treatment for hepatitis B［J］.Viral Hepatol，1999，6（3）：183 －194.

［7］ W illiam E，Delaney IV.The hepatitis B virus polymerasemutation rt v173 is selected during lamivudine therapy and enhances viral replication in vitro ［J］.Virology，2003，77（21）：11833 － 11841.

［8］方军伟，顾美芬.拉米夫定治疗B、B＋C、C基因型慢性病毒性乙型肝炎患者的临床疗效观察 ［J］. 中国预防医学杂志，2009，10（6）：532－533.

［9］Inoue J，Ueno Y，Wakui Y，et al.Four－year study of lamivudine and adefovir combination therapy in lamivudine －resistant hepatitis B patients：influence of hepatitis B virus genotype and resistancemutation pattern［J］.J Viral Hapat，2011，18（3）：206 － 215.

［10］田珊红，胡金华，张 宝，等.阿德福韦酯联合拉米夫定治疗HBV YMDD变异慢性乙型肝炎疗效分析［J］.中国煤炭工业医学杂志，2013，16（1）：7 － 8.