大鼠脊髓损伤后紧密连接蛋白claudin-5的表达

2014-04-27崔敏贺学农周昌龙夏小辉张光伟

中国神经精神疾病杂志 2014年2期

崔敏贺学农周昌龙夏小辉张光伟

崔敏*贺学农*周昌龙*夏小辉*张光伟*

目的检测大鼠脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）后血-脊髓屏障（blood spinal cord barrier,BSCB）紧密连接蛋白claudin-5表达变化。方法120只成年雄性SD大鼠随机分为空白组（60只）和损伤组（60只），损伤组参照改良Allen’s法［2］建立脊髓损伤动物模型。建模后不同时间点（6h、12h、1d、3d、5d、7d）各组随机取5只大鼠检测BSCB通透性，取胸段脊髓损伤区组织经RT-PCR、Western blot方法检测claudin-5表达。结果损伤组制模成功率81.7%；损伤组EB含量随时间变化逐渐升高，在损伤后第3天达峰值（0.9435±0.0813）μg/g，此后逐渐降低（P均＜0.05），各时间点损伤组EB含量较空白组显著增高（P均＜0.05)；损伤组claudin-5 mRNA表达随时间变化逐渐减少，在损伤后第3天表达最低（2.871±0.527），此后逐渐升高（P均＜0.05），各时间点损伤组claudin-5 mRNA表达均较空白组显著降低（P均＜0.05)；损伤组claudin-5表达随时间变化逐渐减少，第3天达最低（0.072± 0.008），之后逐渐增加（P均＜0.05），各时间点损伤组claudin-5表达均较空白组显著降低（P均＜0.05）。结论大鼠SCI后可能通过影响claudin-5的表达改变BSCB通透性，影响脊髓继发损伤的病理生理过程。

脊髓损伤紧密连接claudin-5血-脊髓屏障

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）可致运动、感觉、自主神经功能障碍，其治疗周期长，预后差，给社会与家庭带来沉重压力。SCI后的病理生理过程包括原发性损伤和继发性损伤，血-脊髓屏障破坏是继发损伤的重要环节。紧密连接是血-脊髓屏障的主要构成部分，紧密连接在中枢神经系统的屏障作用(血-脑屏障/血-脊髓屏障)中至关重要，已有大量文献显示紧密连接与血-脑屏障破坏及其通透性改变关系密切[1-3]。本研究检测大鼠脊髓损伤后BSCB紧密连接蛋白claudin-5表达、BSCB通透性，拟揭示脊髓损伤后紧密连接与血-脊髓屏障通透性关系，为脊髓损伤后的继发病理生理过程寻找有效防治措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象成年雄性SD大鼠120只，体质量200～260g，购自本校实验动物中心。伊文斯蓝（Evans blue，EB）购自大连美仑生物技术有限公司，Claudin-5抗体、β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司，PV超敏试剂盒、浓缩型DAB显色试剂盒购自上海研拓生物科技有限公司，TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0试剂盒、100 bp ladder marker购自宝生物工程有限公司，claudin-5及β-actin引物由生工生物工程有限公司设计合成。

1.2 SD大鼠脊髓损伤模型制作按随机数字表将SD大鼠随机分为空白组（n=60）和脊髓损伤组（n=60）。损伤组大鼠参照改良Allen’s法，经10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射后固定，切除T9～T10椎板，显露T9～T10胸髓，allen’s打击器（质量20g，高度25mm）自由落体造成胸髓损伤。空白对照组仅行T9～T10椎板切除。术后保持创口清洁，辅助排尿。造模后不同时间点（6h,12h,1d，3d，5d，7d）各组随机选取5只大鼠处死，留取胸髓损伤区标本作相应指标检测。本实验损伤组大鼠49只制模成功，成功率81.7%，对制模失败大鼠通过随机抽样原则作及时补充，以保证实验大鼠数量恒定。

1.3 血-脊髓屏障通透性测定伊文思蓝（Evens blue，EB）检测大鼠血-脊髓屏障通透性变化。造模后不同时间点（6h,12h,1d，3d，5d，7d）各组随机选取5只大鼠处死，大鼠处死前2h自股静脉注入2%EB溶液（20mg/kg），断头法处死大鼠后取胸髓损伤区标本，加甲酰胺3 mL膜萃取EB，54℃水浴24h后用紫外分光光度计测量波长632nm处的吸光度（A）值，绘制EB标准曲线，根据标准曲线计算EB含量（μg/g）。

1.4 RT-PCR测定claudin-5 mRNA表达造模后不同时间点（6h,12h,1d，3d，5d，7d）各组随机选取5只大鼠处死，取胸髓损伤区标本，按照Trizol说明书提取标本微血管段上的总RNA。在10 μL逆转录反应体系中，将1.0 μg总RNA逆转录为cD⁃NA。Claudin-5上游引物：5’-TTGGAAGGGGCT⁃GTGGAT-3’，下游引物：5’-GGAAAACT⁃GAACTCTGGACGC-3’，反应产物453bp。β-actin上游引物为 5’-TCAGGTCATCACTATCG⁃GCAAT-3’，下游引物为5’-AAAGAAAGGGTGTA⁃AACGCA-3’，反应产物493 bp。PCR反应体积为25 μL，反应条件：95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环。PCR结果采用Ct值比较相对定量法，β-actin为内参照。

1.5 Western-blot法检测claudin-5表达取各组不同时间点大鼠胸髓损伤区标本，加入IP裂解液，匀浆离心、测定蛋白浓度并定量。行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜。5%脱脂奶粉封闭2h，将膜与1∶500稀释的Claudin-5、β-actin抗体4℃孵育过夜，室温下与相应二抗孵育2h，ECL显色。计算各条带光密度值（IDV），以β-actin为内参对照，结果以claudin-5/β-actin的IDV比值表示。

1.6 统计学方法各组实验值以表示。采用SPSS 19.0进行统计处理，多组间均数比较采用单因素方差分析（LSD-t比较两两间差异），两组间均数比较采用两独立样本t检验。检测水准α= 0.05。

2 结果

2.1 血-脊髓屏障通透性测定结果EB检测血-脊髓屏障通透性发现损伤组蓝染明显。空白组各时间点EB含量无明显变化。损伤组EB含量随时间变化逐渐增加，至损伤第3天达峰值（0.9435± 0.0813）μg/g，之后逐渐减少（P均＜0.05），各时间点损伤组EB含量较空白组显著降低（F值为49.801，P均＜0.05）。见表1。

2.2 claudin-5 mRNA表达结果空白组各时间点claudin-5 mRNA表达无明显变化。损伤组clau⁃din-5 mRNA表达随时间变化逐渐减少，第3天达最低（2.871±0.527），之后逐渐增加（P均＜0.05），各时间点claudin-5 mRNA表达较空白组显著降低（F值为14.451，P均＜0.05）。见表2。

2.3 claudin-5表达结果空白组各时间点clau⁃din-5表达无明显变化。损伤组claudin-5表达随时间变化逐渐减少，第3天达最低（0.072±0.008），之后逐渐增加（P均＜0.05），各时间点claudin-5表达较空白组显著降低（F值为19.462，P均＜0.05）。如表3、图1。

3 讨论

图1 Western-blot法测claudin-5表达

血-脊髓屏障通透性改变是脊髓继发损伤的重要环节，影响脊髓损伤的病理生理过程，如临床常见的继发脊髓水肿。血-脊髓屏障的构成包括星形胶质细胞足突、血管基膜、血管内皮细胞以及内皮细胞之间的紧密连接（tight junction,Tj）。血管基膜分离，毛细血管内皮细胞的囊泡转运增加，紧密连接间隙扩大[4]等均可致BSCB通透性改变。Tj是中枢神经系统血管内皮细胞之间的主要连接方式，Tj由跨膜蛋白（claudins、occludin、JAM）、胞质粘附蛋白(Z0-1、ZO-2、ZO-3)、胞浆骨架蛋白(F-actin)组成,其中claudins蛋白家族被证明是Tj的主要构成蛋白，occludin和JAM主要参与对Tj的调节。claudins蛋白包括4个跨膜区域、两个胞外环、胞浆侧氨基端和羧基端，其第1、4跨膜区域及胞外环结构保守，而第2、3跨膜区域结构多样化[5]。claudins家族包括20余成员，分布于多种组织细胞紧密连接中，中枢神经系统的BSCB和BBB血管内皮细胞Tj均主要由claudin-5组成，在维持BSCB、BBB正常功能中起至关重要作用[4]。研究发现:claudin-5表达下调，在电镜下可见BBB的Tj结构完整性破坏，通过EB检测发现claudin-5表达变化与BBB通透性相关[2,6]。Aslam M等报道[1]：TNF-α通过NK-kB信号通路上调p65,抑制clau⁃din-5表达，从而改变大鼠血-脑屏障通透性。

目前中枢神经系统屏障研究主要集中于BBB，BSCB研究较少。本文研究发现，脊髓损伤后claudin-5表达随时间变化逐渐下降，3d左右下降至最低，之后逐渐上升。检测EB含量随着时间变化逐渐增加，3d左右增加明显，之后逐渐下降。上述结果提示，脊髓损伤后claudin-5表达降低，血脊髓屏障通透性增加，这一过程参与脊髓损伤后的继发损害。脊髓损伤后claudin-5表达变化的机制不清楚，已知Claudin-5对维持BBB正常功能至关重要，在大鼠神经炎症模型中[7]，通过抑制糖原合成酶激酶（GSK3b）发现紧密连接蛋白的翻译过程受调控，claudin-5、0ccludin表达增加，BBB屏障通透性逐渐降低。进一步研究发现GSK3b的失活能显著的增加claudin-5、occludin的半衰期，促进BBB稳定。在大脑中动脉栓塞大鼠模型中[8]，微囊蛋白1发生胞质易位，紧密连接蛋白claudin-5、occludin降解增快，促进紧密连接破坏，BBB通透性增加。利用siRNA干扰微囊蛋白1，发现微囊蛋白1主要参与对claudin-5的破坏，通过共同免疫沉淀法进一步确定微囊蛋白1与claudin-5的相互作用，提示脑缺血后启动微囊蛋白1调控claudin-5，加剧BBB破坏。我们推测，脊髓损伤后活性GSK3b增加以及微囊蛋白1分布发生改变，可能通过对claudin-5蛋白翻译调控及直接降解作用，缩短claudin-5半衰期并促进其降解，从而改变BSCB结构，增加BSCB通透性。

表1 大鼠胸髓损伤区EB含量测定结果（μg/g±s）

1）经LSD-t检验，与空白组比较，P＜0.05

组别空白组损伤组7d 0.2974±0.0322 0.5296±0.04211）n 5 5 5 0.2914±0.0176 0.5004±0.01791）12h 0.2915±0.0177 0.6913±0.02681）1d 0.3049±0.0307 0.8432±0.04321）3d 0.3197±0.0556 0.9435±0.08131）5d 0.2977±0.0259 0.7328±0.06121）

表2 大鼠胸髓损伤区claudin-5 mRNA表达水平（Ct值）

1）经LSD-t检验，与空白组比较，P＜0.05

7d 8.844±0.882 5.908±0.3011）组别空白组损伤组n 5 5 6h 8.868±0.502 6.754±0.3191）12h 8.963±0.690 5.231±0.5041）1d 9.193±0.760 4.078±0.2901）3d 9.001±0.504 2.871±0.5271）5d 8.960±0.282 4.658±0.5291）

表3 大鼠胸髓损伤区claudin-5表达水平（IDV比值）

1）经LSD-t检验，与空白组比较，P＜0.05

组别空白组损伤组n 5 5 6h 0.357±0.010 0.241±0.0091）12h 0.362±0.036 0.188±0.0121）1d 0.371±0.025 0.121±0.0101）3d 0.368±0.018 0.072±0.0081）5d 0.377±0.026 0.133±0.0091）7d 0.385±0.023 0.280±0.0211）

在慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根病中[6]，糖皮质激素可上调内皮细胞claudin-5表达，增强血-神经屏障功能。体外血-脑屏障模型研究也进一步证实糖皮质激素增强BBB的屏障功能，在DH-BNBs细胞系中，当提供糖皮质激素后虽然oc⁃cludin表达没有变化，但claudin-5表达增加，屏障功能显著增强。这一研究与临床脊髓损伤后糖皮质激素使用可明显改善患者预后相符合。推测脊髓损伤后，糖皮质激素可能通过上调claudin-5表达，增强BSCB屏障功能，改善脊髓继发水肿过程。此外，Echeverry S、肖颖秀等[9,10]报道，炎症介质对BBB紧密连接蛋白破坏及通透性改变也起重要作用，如IL-17作用于中性粒细胞致基质金属酶分泌增加，从而直接降解紧密连接蛋白致屏障完整性破坏，而糖皮质激素也可能通过抑制炎症反应参与BSCB紧密连接完整性的保护。

本研究提示脊髓损伤后claudin-5表达变化与血-脊髓屏障通透性改变可能相关。脊髓损伤后可能通过影响claudin-5的表达改变BSCB通透性，致脊髓继发损伤的病理生理过程。进一步研究影响claudin-5表达变化的具体因素及机制将为脊髓损伤治疗提供思路。

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The expression of tight junction protein claudin-5 after spinal cord injury about rats.

CUI Min,HE Xuenong,

ZHOU Changlong,XIA Xiaohui,ZHANG Guangwei.Department of neurosurgery,the yongchuan affiliated hospital,Chongq⁃ing medical university,Chongqing 402160,China.Tel:023-85382926.

ObjectiveTo examine the expression of tight junction protein claudin–5 in blood-spinal cord barrier (BSCB)after spinal cord injury about rat.MethodsOne hundred-twenty adult male SD rats were randomly divided into blank group(60)and injured group(60).The animal model of spinal cord injury was established using modified Allen method.The expression of claudin–5 in BSCB was examined at 6 h,12 h,1 d,3 d,5 d and 7 d(five rats per time point). Western blot and RT_PCR were used to detect protein and mRNA expression levels of claudin-5,respectively.ResultsThe success rate of spinal cord injury molding was 81.7%.In injured group,EB content increased gradually over time, reached the peak at the third day（0.9435±0.0813）μg/g and then reduced gradually(P＜0.05),EB content was signifi⁃cantly higher in injured group than in blank group.Claudin-5 mRNA expression in injured group reduced gradually over time and reached the lowest point at the third day（2.871±0.527）and then increased gradually（P＜0.05）.Claudin-5 mRNA expression was significantly lower in injured group than in blank group（P＜0.05).Claudin-5 protein expression in injured group reduced gradually over time,reached the lowest at the third day（0.072±0.008）and then increased gradually（P＜0.05）.Claudin-5 protein expression was significantly lower in injured group than in blank group（P＜0.05).Con⁃clusions The alteration of claudin-5 expression after SCI may lead to the permeability of BSCB,which may in turn con⁃tribute to the secondary spinal cord injury.

Spinal cord injury Tight junction Claudin-5 Blood-spinal cord barrier

R641

2013-10-26）

（责任编辑:甘章平）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.02.004

* 重庆医科大学附属永川医院神经外科（重庆402160）