血管生成素1对脑缺血再灌注损伤保护作用及其机制

庄越 金文香

血管生成素1对脑缺血再灌注损伤保护作用及其机制

庄越*金文香△

目的 观察血管生成素1对沙土鼠全脑缺血再灌注损伤后脑血流S-100β蛋白表达的影响，以及对肿瘤坏死因子-（tumor necrosis factor-）和IL-1、(interleukin-1)的影响，探讨其对脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法健康成年沙土鼠45只，随机分3组（每组n=15只）：假手术组（sham operation group,S组）；缺血再灌注组（ischemia-reperfusion group,IR组）；血管生成素1组（angiopoietin-1 group，Ang1组）；于缺血前(T0)、再灌注2 h (T2)、再灌注6 h(T3)、再灌注12 h(T4)、再灌注24 h(T5)各时间点抽取颈静脉血测S-100β蛋白含量、TNF-a、IL-1的含量的变化；并于各时间段监测颈静脉血样氧饱和度（jugular venous oxygen saturation,SjvO2）。结果①与S组比较IR组血清TNF-a、IL-1、S-100ß蛋白含量显著增高(0.815±0.080μg/L)（P＜0.05）。Ang1组也较S组升高但幅度低于IR组（P＜0.05）(0.58±0.11μg/L)；②Ang1组的SjvO2明显高于IR组相对应时间点（P＜0.05）(82%±12%)。结论血管生成素1可能通过减轻脑血管炎症反应过程和维持血管内皮细胞完整性来减轻脑血管内皮细胞缺血再灌注损伤从而起到保护作用。

S-100β蛋白血管生成素-1肿瘤坏死因子-a 白介素1(IL-1)颈静脉血氧饱和度

血管生成素1(angiopoietin-1，Ang1)于1996年被发现[1]，是血管内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶Tie-2的配体。具有强的促血管生长作用的细胞因子，抑制内皮细胞凋亡，促进内皮细胞出芽、迁移、稳定血管，在组织修复及血管发生方面起一定作用。S-100β蛋白是一种相对分子量为21×103的酸性钙结合蛋白，血液中很难检测到。呈浓度特异性地存在于中枢神经系统胶质细胞和星形细胞中，当神经元细胞受损时，将释放大量的S-100β蛋白通过受损的血脑屏障进入血液中。因此本研究以S-100β蛋白作为主要观察指标来研究Ang1对全脑缺血再灌注损伤脑保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组与模型制备 健康蒙古沙土鼠60只（由广州医科大学动物实验中心提供），体重50～80 g，雌雄不拘；随机分3组：假手术组（S组，n= 15）；缺血再灌注组（IR组，n=15）；Ang1组（n=15）；余下沙土鼠子作为异常死亡或造模失败的补充。脑缺血大鼠模型的建立按Longa线栓法[2-3]制作大鼠脑缺血再灌注损伤模型：腹腔注射10%水合氯醛3.5mL/kg麻醉，做颈部正中切口1 cm,暴露右颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈外动脉分支，在颈外动脉距其始端约2mm处做一小切口，用3.0尼龙线一端烤成小球形，小球端经切口处插入颈外动脉，再经颈内外动脉分叉处插入约2 cm至大脑中动脉，栓塞1 h制备脑缺血模型，缝合切口并留线至外端。拔出丝线即为再灌注开始记时。同时分离右侧颈内静脉并逆行穿刺置入24G，BD留置针管至球部，备抽血采样及静脉补液用以防止多次抽血对血压波动的影响。一侧股动脉穿刺置管连接换能器进行血流动力学监测。a、Ang1组再灌注开始腹腔立即注射人重组Ang1剂量为300μg/kg；IR组再灌注开始立即腹腔注射相同体积的生理盐水；S组只剥离双侧颈总动脉不栓塞同样腹腔注射相同体积的生理盐水。

1.2 神经功能缺损体征评分 参照Longa标准进行神经功能评分[2]。按上述标准，于再灌注后第24 h记录各组动物死亡情况，并参照文献[4-5]:2级(1分)～4级(3分)为入组标准即成功造模。排除标准：实验沙土鼠在缺血开始后30～60 s内未出现①昏迷，翻正反射消失，②能自主呼吸，③双侧瞳孔放大，痛觉反射消失，神经行为学症状的沙土鼠子弃用；以及在缺血期死亡或实验过程中出现抽搐的沙土鼠均被弃去。

1.3 标本的采集与检测 各组分别于缺血前(T0)、再灌注2 h(T1)、再灌注6 h(T2)、再灌注12 h(T3)、24h（T4）各时间点抽取颈静脉球部血1 mL，常温下3000 r/min离心10min，取上清液置于-70℃冰箱保存待测。采用酶联免疫法(ELISA)，严格按试TNF-α，IL-1、S-100β蛋白试剂使用步骤测定血清TNF-α，IL-1、S-100β蛋白浓度。

1.4 脑组织氧代谢检测计算SjvO2各组分别于各时点，分别自股动脉和颈静脉球部抽血测Hct、血气分析、乳酸含量。计算动脉-颈内静脉球部血氧含量差（Da-jvO2）根据Fick原理：SjvO2=SaO2—CMRO2/(CBF×CaO2)，动脉-颈内静脉球部血氧含量差（Da-jvO2）=CMRO2/CBF[3]。

1.5 脑含水量 各组分别取10只大鼠，分别在再灌注2 h和24 h时用10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉，迅速断头取脑，用滤纸吸干大脑表面水分和血液。取缺血侧大脑半球，用电子天平称量其湿重。然后将其放入电热干燥箱中以120℃烘干，直至称量的两次重量差小于1%湿重，则最后一次重量为干重，按以下公式计算脑含水量：(湿重－干重)÷湿重×100%。

1.6 统计学方法 所有数据应用SPSS统计软件13.0版本进行统计分析。计量资料均以（±s）表示。组内比较两样本均数成正态分布的比较采用配对t检验，非正态分布用曼惠特尼U检验；多时间点比较用重复测量方差分析；组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1S-100β蛋白 IR组与S组比较在T2、T3、T4时的血清S-100β蛋白显著升高（0.815±0.080μg/L）；与T1时比较随再灌注时间延长而增加；Ang1组在T2、T3、T4时血清S-100β蛋白较S组各观察时间点也增高（P＜0.05）；但Ang1组的增幅均明显低于IR组（P＜0.05），见表1。

2.2 炎症介质TNF-α、IL-1IR组在T2、T3、T4时的血清TNF-α、IL-1表达较S组显著增高（P＜0.01）；组内比较也较T0、T1时显著增高（P＜0.05）；Ang1组在T2、T3、T4时血清TNF-α表达较S组增高；但Ang1组的增幅均明显低于IR组相对应时间点（P＜0.05），见表2、表3。

2.3SjvO2IR组在T1、T2观察SjvO2明显降低（P＜0.01），Ang1组在T1、T2时SjvO2也降低（P＜0.05）但降低幅度低于IR组（P＜0.05），见表4。

2.4 脑水含量 与S组比较，在T1、T4时I/R组和Ang1组脑含水量显著升高(P＜0.05)；在T1、T4时与I/R组比较，Ang1组脑含水量降低（P＜0.05），见表5。

3 讨论

本实验以沙土鼠作为造模动物，因沙土鼠颈内动脉系统和椎动脉系统的脑底动脉环后交通支先天缺损或发育不全不能构成完整的Willis动脉环[6]。并以Longa法建立脑缺血模型，因此技术很成熟，成功率高。参照Longa标准进行神经功能评分，并参照文献[4-5]:2级(1分)～4级(3分)为入组标准即成功造模。

表1 血浆S-100β蛋白浓度(μg/L)

表2 血浆TNF-α浓度(ng/L)

表3 血浆IL-1浓度(ng/L)

表4 SjvO2（%）指标

表5 各组缺血再灌注后不同时间点脑含水量（%）的比较（±s）

表5 各组缺血再灌注后不同时间点脑含水量（%）的比较（±s）

1）与S组比较，经t检验10）P＜0.05；2）与IR组比较，经单因素方差分析11)P＜0.05

组别S组IR组Ang-1组n 10 10 10 T1 76.43±9.26 85.86±8.4810）80.78±2.8410)11)T4 76.47±3.39 88.02±4.0310)82.37±1.2910)11)

本实验把S-100β蛋白作为判断血脑屏障损伤即脑缺血再灌注损伤的监测指标,是因为S-100β蛋白分子量大，正常情况下很难通过血脑屏障，脑血流中很难检测到。研究表明[7]脑损伤后20min后即可检测到血清浓度升高，2 h后升高明显，大量研究证明[8-9]：缺血缺氧是诱导神经细胞内S-100β蛋白基因表达的重要因素，可作为中枢神经系统损伤较为特异和灵敏的指标。实验结果示IR与S组比较其浓度明显升高（P＜0.05），说明其损伤明显存在，并随灌注时间延长而增加，其增加趋势与炎症介质增加趋势一致。说明损伤程度与炎症反应程度有相关性，而在血管生成素1干预下，能明显降低缺血再灌注后颈静脉血TNF-α（79.32±4.97 ng/L；）、IL-1（458.12±27.16 ng/L）的炎症介质含量和S-100β蛋白的血清含量（0.13±0.04 μg/L）；并能降低再灌注损伤脑水含量（82.37%± 1.29%）（P＜0.05），减轻脑水肿。从而可以进一步认为：血管生成素1可能通过干预炎症反应等途径达到保护脑血管内皮细胞完整性的作用。这与关于血管紧张素1：可抑制炎性反应过程中TNF-α诱导的白细胞游出及血栓素诱导的中性粒细胞黏附和白细胞介素IL-1β等的合成［10］研究结果相符合。

因为脑缺血再灌注损伤发生机制为：再灌注时大量分子氧进入缺血组织产生O2-、OH-等大量氧自由基激活诱导相关转录因子调控的炎症基因的表达导致炎性细胞因子：血小板活化因子(PAF)、肿瘤坏死因子(TNF-α)白细胞介素IL-1β、等表达增多，在本研究观察再灌注2 h（T2）检测TNF-α、IL-1β浓度明显升高（79.32±4.97 ng/L、458.12±27.16 ng/L），且随时间延长呈增加的趋势，而此增加趋势与S-100β蛋白浓度增加相一致。说明血脑屏障损伤伴随炎症介质的升高即炎症反应发生。由于观察时点选择不同，各项观察指标何时开始升高以及何时达浓度峰值还有待于进一步研究。炎症介质增加诱导脑受损区域内皮细胞表面的细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、P、E选择素表达增加，粘附分子和中性粒细胞表面的互补受体反应，介导中性粒细胞等与内皮细胞粘附，阻塞微血管，导致血管闭塞而引发“无复流现象”[11]，加重脑缺血进而产生脑水肿和坏死[12]，血脑屏障紧密连接损坏、通透性增高，从而使平时不能通过血脑屏障的大分子蛋白[13]如S-100β蛋白渗出，因此脑血流中能监测较高浓度的S-100β蛋白。

综上所述：血管生成素1可能通过减轻脑血管炎症反应过程和维持血管内皮细胞完整性来减轻脑血管内皮细胞缺血再灌注损伤从而起到保护作用。对于本实验中观察时点的选择以及其给药剂量和时机尚需进一步研究。

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A

2013-11-13）

（责任编辑:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.05.011

*广州开发区医院麻醉科(广州510730)

广州医科大学第二附属医院麻醉科