猴头菌丝多肽的制备及抗氧化活性研究

徐 艳，丁 静，孙桂红，国 骏，纪明山*

（1.沈阳农业大学 植物保护博士后流动站，辽宁 沈阳 110161；2.沈阳农业大学 生物科学技术学院，辽宁 沈阳 110161）

猴头菌（Hericium erinaceus）是著名的药食兼用真菌，具有抗衰老、降血糖、抗菌、抗肿瘤等作用[1-2]。随着现代发酵技术的进步，猴头菌的生产也由田间栽培发展到液体发酵生产。研究表明，药食用真菌液体发酵产物中的蛋白质、氨基酸、多糖类等含量远高于天然或人工栽培的子实体，因此，猴头菌液体发酵产物具有重要的研究开发价值[3]。猴头菌具有抗氧化作用，其中必含有抗氧化活性物质。目前，猴头菌抗氧化活性的研究主要集中在猴头多糖上[4-6]，但有研究表明，猴头菌抗氧化活性与温度关系密切。随着烘烤温度升高，猴头菌清除超氧阴离子自由基的能力显著降低[7]。因此，可以推测出猴头菌中起抗氧化作用的物质除多糖外，还可能有其他活性物质，尤其是不耐热的蛋白类成分。本研究前期试验也证明了猴头发酵菌丝体中，蛋白类成分多种体系的抗氧化活性明显高于猴头菌丝多糖[8]。随着营养学和生物技术的发展，人们发现，多肽类食用安全性更高，且具有极强的活性和多样性，其抗氧化性相比于蛋白质和氨基酸往往更为显著[9-10]。因此，利用特异的蛋白酶水解，使猴头发酵菌丝体蛋白释放出食源性抗氧化肽有更重要的意义[11]。

本论文以猴头菌液体发酵菌丝体为材料，通过反复冻融法提取其活性蛋白，并以4种蛋白酶水解蛋白获得蛋白酶解肽，并研究多肽的含量及抗氧化活性，从而筛选最优蛋白酶。再利用4因素3水平的正交试验，将此蛋白酶的水解条件进行优化，获得猴头菌丝抗氧化肽的最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猴头菌（Hericium erinaceus）：购自辽宁省农科院；中性蛋白酶（酶活200 000 U/g）、木瓜蛋白酶（酶活800 000 U/g）、酸性蛋白酶（酶活50000U/g）、碱性蛋白酶（酶活200000U/g）：江苏锐阳生物科技有限公司；氯化硝基四氮唑蓝（Nitro-Blue tetrazolium chloride，NBT）：上海恒星应用化学研究所；核黄素：北京奥博星生物技术责任有限公司；1,1-二苯-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，纯度95%）：A Johnson Matthey Company；牛血清白蛋白对照品：北京奥博星生物技术有限公司提供，批号为21 060418；福林-酚试剂：北京中生瑞泰科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-6数字恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；TD4A-低速离心机：北京医用离心机厂；SHB-III循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；Region-detail-tR-201D旋转蒸发仪：上海科兴仪器有限公司；日光灯反应箱：自制；DL-CJ-2N超净工作台：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；全自动高压灭菌锅：SANYO Electric Co.，LTD；HPX-9272MBE数显电热培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；722S可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 猴头菌丝多肽制备工艺流程

（1）培养基的配制

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）固体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL。种子培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，酵母膏1 g，KH2PO42 g，MgSO41 g，VB10.1 g，pH6.5。发酵培养基：可溶性淀粉25 g，酵母膏25 g，KH2PO41 g，MgSO41 g，VB10.1 g，pH 5.0。培养基均配成1 L，100 mL/瓶分装于三角瓶中，121 ℃灭菌20 min后置于超净工作台冷却备用。

（2）猴头菌种子液的制备

在超净工作台上将PDA固体斜面培养好的猴头菌用接种环取1环置于种子培养基中，27 ℃摇床中培养，一周后收集种子液。

（3）猴头菌丝的制备

将培养好的猴头菌种子液按10%的接种量接入发酵培养基中，27 ℃摇床中培养，待菌丝生长成熟后将其过滤，水洗后低温烘干备用。

（4）猴头菌丝多肽的制备

菌丝蛋白成分的制备：将收集的菌丝干燥后研磨成粉末，取菌丝粉末各2 g于烧杯中，加水20 mL，冻融24 h，离心取上清。

菌丝蛋白酶解肽的制备[12]：用不同的蛋白酶水解猴头菌丝蛋白。各类酶的水解条件分别为碱性蛋白酶pH值为9.0，55 ℃；中性蛋白酶pH值为7.0，40 ℃；酸性蛋白酶pH值为3.5，40 ℃；木瓜蛋白酶pH值为6，50 ℃；加酶量均为60 U/mL，时间2 h，水解后85 ℃、10 min灭酶，4 000 r/min离心，获得猴头菌丝多肽提取液。

1.3.2 猴头菌丝多肽抗氧化活性的测定

（1）清除超氧自由基活性的测定[13]

采用光照核黄素体系产生超氧自由基。用0.05 mol/L pH值为7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制1.67×10-5mol/L核黄素，0.01 mol/L蛋氨酸，4.6×10-5mol/L氯化硝基四氮唑兰（NBT）。分别取上述3种溶液各2.0 mL，加入不同浓度的样品溶液1.0 mL，空白管以1.0 mL缓冲液代替样品溶液。置于光照箱中光照20 min，取出后以缓冲溶液为参比于波长560 nm处测定溶液的吸光度值。O-2·清除率按下式计算。

式中：A0为空白管的吸光度值；A样为样品管的吸光度值。

（2）清除羟自由基活性的测定[14]

取各样品液1 mL，加入12 mmol/L水杨酸钠0.5 mL，0.9 mol/L FeSO40.5 mL，最后加18 mmol/L H2O21 mL启动反应，37 ℃恒温水浴反应1 h后5 000 r/min离心10 min，取上清液并稀释至10 mL，在波长510 nm处用分光光度计测吸光度值A，根据以下公式计算·OH的清除率。

式中：A为不加样品时体系的吸光度值，A1为加入样品后体系的吸光度值，A2为样品的本底吸光度值。

（3）清除DPPH·活性的测定[15]

采用提取物与稳定自由基DPPH反应的分析方法。在同一具塞试管中加入2 mL DPPH溶液（2×10-4mol/L），1 mL不同浓度样品溶液，摇匀，室温避光静置30 min，用无水乙醇作参比在波长517 nm处测定吸光度值A样品。用1 mL无水乙醇代替样液，测定空白吸光度值A空白。用2 mL无水乙醇代替DPPH，测定吸光度值A对照。样品对DPPH·的清除率按下式计算。

（4）还原力的测定[16]

本研究采用铁离子还原法（FRAP）和铁氰化钾还原法来测定各样品的还原力。具体方法：分别取2.5 mL不同浓度的样品于试管中，依次加入2.5mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸盐缓冲液和2.5 mL 1%K3[Fe（CN）6]于50 ℃水浴保温20 min后，快速冷却，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸，以4 000 r/min的转速离心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL重蒸水，0.5 mL 0.1% FeCl3，充分混匀，静置10 min，在波长700 nm处测定吸光度值，以重蒸水为阴性对照。以吸光度值表征样品的还原力，吸光度值越大则样品的还原能力越强。

1.3.3 菌丝蛋白酶解肽多肽含量测定[17]

牛血清白蛋白对照品溶液：取牛血清白蛋白对照品15.2 mg，加水溶解并定容至50 mL，得质量浓度为0.304 mg/mL，按福林-酚试剂说明进行操作，根据对照品溶液质量浓度与吸光度值关系绘制标准曲线。

供试品溶液的多肽含量测定：取供试品溶液配成浓度梯度，按福林-酚试剂说明进行操作，根据对照品溶液标准曲线计算多肽含量。

1.3.4 单因素对菌丝蛋白酶解肽抗氧化活性及多肽含量的影响

在底物浓度不变的情况下，对加酶量、酶解时间、温度、pH值这4个因素进行单因素影响试验。

（1）加酶量对菌丝蛋白酶解肽抗氧化活性及多肽含量的影响：用木瓜蛋白酶水解猴头菌丝蛋白，pH值为6，50 ℃，加酶量分别为40U/mL、60U/mL、80U/mL、100U/mL、120U/mL，水解时间2 h，水解后85 ℃、10 min灭酶，4 000 r/min离心，获得猴头菌丝多肽提取液。比较还原力和多肽含量，确定加酶量。

（2）酶解时间对菌丝蛋白酶解肽抗氧化活性及多肽含量的影响：同方法（1），酶解时间分别为0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h。比较还原力和多肽含量，确定酶解时间。

（3）温度对菌丝蛋白酶解肽抗氧化活性及多肽含量的影响：同方法（1），处理温度分别为40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃。比较还原力和多肽含量，确定水解温度。

（4）pH值对菌丝蛋白酶解肽抗氧化活性及多肽含量的影响：同方法（1），pH值分别为4、5、6、7、8。比较还原力和多肽含量，确定处理pH值。

1.3.5 正交试验确定猴头菌丝抗氧化肽制备的最佳酶解工艺

在单因素试验基础上，以正交试验确定猴头菌丝抗氧化肽制备的最佳优化条件。

2 结果与分析

2.1 猴头菌丝不同蛋白酶解肽抗氧化活性的测定结果

不同蛋白酶解肽抗氧化活性的测定结果见表1。

表1 不同蛋白酶解肽抗氧化活性的测定结果Table 1 Determination results of antioxidant activity of different enzymatic hydrolysis peptide

2.2 蛋白酶解肽的多肽含量测定

根据对照品溶液含量及吸收值，可得线性方程y=1.518 1x－0.035 8，其中相关系数R2=0.999 2，由线性方程计算各多肽含量。标准曲线见图1。

图1 多肽含量标准曲线Fig.1 Standard curve of polypeptide content

2.3 单因素对菌丝蛋白酶解肽抗氧化活性及多肽含量的影响

单因素对菌丝蛋白酶解肽抗氧化活性及多肽含量的影响见图2～图5。

由图2～图5可知，加酶量在40～100 U/mL之间，多肽含量及还原力随着加酶量增加而增大，加酶量大于100 U/mL后多肽含量及还原力的变化不大，故本反应体系的最佳加酶量在60～100 U/mL之间；水解时间在0.5～3.0 h之间，多肽含量及还原力随着水解时间的增加而增加，主要是前期酶活力高，产物的抑制作用小。但当水解时间＞3.0 h后多肽含量增幅很小，主要是由于酶解时间的延长，酶活力逐渐下降。故本反应体系的最佳水解时间在1.0～3.0 h之间；提取温度在40～55 ℃范围内，随着温度的提高，多肽含量增加及还原力增强，主要是因为温度的提高使蛋白酶与底物的碰撞机率增加。但提取温度超过55 ℃以后多肽含量逐渐减小，可能是因为温度升高使蛋白酶结构发生改变，造成酶活力降低。本试验条件下，最佳温度范围为50～60 ℃；对于pH值，pH值5～7时酶解效果最好。因为木瓜蛋白酶本身也是蛋白质，在碱性条件下酶活力会受到影响，而且pH值过大时会产生毒性物质，故本反应体系的最佳pH值范围在5～7。

图2 加酶量对还原力和多肽含量的影响Fig.2 Effect of enzyme addition amount on reducing power and polypeptide content

图3 水解时间对还原力和多肽含量的影响Fig.3 Effect of hydrolysis time on reducing power and polypeptide content

图4 温度对还原力和多肽含量的影响Fig.4 Effect of temperature on reducing power and polypeptide content

图5 pH值对还原力和多肽含量的影响Fig.5 Effect of pH value on reducing power and polypeptide content

2.4 正交试验

以单因素试验结果为依据，选取木瓜蛋白酶加酶量、酶解时间、温度、pH值作为4个影响因素，各因素确定3个水平，以还原力和多肽含量为指标，进行4因素3水平L9（34）正交试验，确定最佳工艺参数。因素水平见表2，正交试验结果见表3，方差分析结果见表4。

从表3可以看出，菌丝多肽含量与抗氧化活性具有一致性，即多肽含量越高，抗氧化活性越强。以还原力为指标，考察木瓜蛋白酶各因素对猴头菌丝抗氧化活性的影响。极差分析结果表明，加酶量、pH值、水解时间、温度4个因素对抗氧化活性均有影响，4个因素影响程度的排列顺序为：加酶量＞pH值＞水解时间＞温度。表4方差分析结果表明，4个因素对抗氧化活性影响均不显著。根据正交试验结果确定最佳酶解工艺条件为A2B1C2D2，即加酶量80 U/mL，时间1 h，温度50 ℃，pH 6.0。

表2 猴头菌丝多肽含量及还原力优化正交试验因素与水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test for Hericium erinaceus mycelium polypeptide content and reducing power activity optimization

表3 猴头菌丝多肽含量及还原力优化正交试验正交试验结果与分析Table 3 Result and analysis of orthogonal test for Hericium erinaceus mycelium polypeptide content and reducing power activity optimization

表4 正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test result

2.5 正交试验的结果验证

采用酶解条件：木瓜蛋白酶加酶量80 U/mL，时间1 h，温度50 ℃，pH6.0，对猴头菌丝蛋白进行酶解，产生的酶解产物还原力（OD700nm）为1.035，此时的多肽含量为2.390 mg/g菌丝，即与最优组合基本吻合。

3 结论

木瓜蛋白酶是水解猴头菌丝蛋白的最佳酶。加酶量是影响猴头菌丝抗氧化肽制备的最主要因素。猴头菌丝抗氧化肽对超氧阴离子自由基、羟基自由基和DPPH自由基均有良好的清除能力，且呈现较好的量效关系，有望作为天然抗氧化剂和功能性食品而得到开发应用。

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