蛹虫草大米培养基中多糖提取及初步纯化工艺

陈小丽，郑华章，涂玉佩，巫光宏*

（1.广东海洋大学 水产学院，广东 湛江 524088；2.华南农业大学 生命科学学院，广东 广州 510642）

蛹虫草人工培养较为成功，其培养基中残留有一定含量的多糖，将此多糖提取研究可提高培养基利用价值、节约资源。但是，大米、小麦等固体培养基中含有大量淀粉，而目前的多糖测定方法主要是通过定量总糖含量间接计算得到多糖含量[10-11]，大量淀粉会干扰对蛹虫草多糖的测定，无法准确计算多糖含量，现有研究却大多未考虑这一问题[12-14]。为了准确定量培养基中多糖含量，有必要先除去淀粉，再进行多糖的提取和测定。但是，如何在除去淀粉的同时尽量降低蛹虫草多糖的损失率是一大难题。本研究探索了Ca（NO3）2法去除蛹虫草大米培养基中大量的淀粉，然后采用水提法提取蛹虫草多糖，为准确定量蛹虫草培养基多糖含量提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛹虫草子实体大米培养基：深圳澎源生物科技有限公司。

硝酸钙：广东台山粤侨试剂塑料有限公司；氯仿：天津市大茂化学试剂厂；正丁醇：广东光华化学厂有限公司；浓硫酸、可溶性淀粉：广州化学试剂厂。以上试剂为分析纯。

1.2 仪器与设备

DK-S24电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；5810R高速冷冻离心机：德国EPPENDORF公司；TG16-WS高速离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；UV-1100分光光度计：青岛紫泉仪器有限公司；AB104-N电子天平：梅特勒-托利多集团；60目试验标准筛：浙江上虞市华康化验仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 淀粉含量的测定方法[15-16]

淀粉含量的测定采用碘显色法：淀粉与I2能特异性结合形成蓝色复合物，600 nm为碘与淀粉复合物的最大吸收波长。碘-碘化钾溶液（I2-KI）用量影响显色深度，随用量增大，显色加深，但并不呈线性增加，加入100 μL 0.2%I2-KI时获得较好的结果。采用Ca（NO3）2提取淀粉时，其浓度对显色有较大影响，本试验需要对不同质量分数的Ca（NO3）2去除淀粉进行正交试验，因而分别作出不同质量分数的Ca（NO3）2溶解淀粉对应的标准曲线。

取梯度用量（0、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL）的淀粉溶液（0.01%），补加纯水至4 mL，加入0.2%的I2-KI 100 μL，测定OD600nm，以其为横坐标，淀粉含量（mg/mL）为纵坐标绘制标准曲线。将淀粉分别用质量分数为50%、65%和80%的Ca（NO3）2溶解，同时用相应质量分数的Ca（NO3）2溶液补加至4 mL，按上述方法分别作出淀粉标准曲线。样品淀粉含量计算公式如下：

对于一个接受英国教育，但是又长期生活、工作在印度，作品多取材自印度的作家来说，吉卜林不仅书写了印度，也书写了印度与英国之间的敏感关系，更多的是在殖民帝国时期的英国与印度的双重社会文化语境下，诉说作为“英印人”的独特的自我感受。

式中：X为标准曲线上查得的样品淀粉质量浓度，mg/mL；4为反应体系总体积，mL；Vt为样品总体积，mL；Vu为每支测定试管中加入的样品体积，mL；M为样品稀释倍数。

1.3.2 淀粉去除条件优化正交试验

称取过60目筛的蛹虫草培养基粉末2.0 g，加60 mL 体积分数为80%乙醇碾磨，离心，残渣用60 mL蒸馏水悬浮洗涤一次，离心，去上清。所得残渣按正交设计参数用Ca（NO3）2溶液悬浮，沸水浴10 min，4 000 r/min离心10 min，上清液透析除Ca（NO3）2，测定淀粉质量，淀粉去除率计算公式如下：

式中：C1、C2分别为去除淀粉前和去除淀粉后样品中淀粉质量，mg。

在单因素试验的基础上，以淀粉去除率为考察指标，选取影响淀粉去除率的3个因素进行L9（34）正交试验设计，淀粉去除条件优化正交试验因素与水平见表1。

表1 淀粉去除条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for starch extraction condition optimization

在正交试验基础上，按上述试验获得的最优方案追加淀粉去除试验，提取淀粉4次，分别用碘显色法测定每次提取所得溶液中淀粉的含量。提取4次之后的残渣用于提取虫草多糖，并测定粗提液中的淀粉含量，合并得淀粉总含量，计算淀粉去除率。

1.3.3 蛹虫草多糖提取条件优化正交试验[17]

在单因素试验的基础上，选取影响多糖提取率的4个因素进行正交试验，因素与水平设计见表2。按1.3.2 最优方案除去淀粉，所得残渣按设计条件提取多糖，将提取液冷却，10 000 r/min 离心10 min，上清液即为蛹虫草多糖粗提液。苯酚-硫酸法[10]测定多糖含量，以多糖得率为考察指标，确定最佳提取方案。多糖含量及得率计算公式如下：

多糖含量（mg）=（Ct-Cr）×0.9

式中：Ct为标准曲线查得的样品总糖含量，mg；Cr为标准曲线查得的样品还原糖含量，mg；0.9为校正系数。

式中：Cp为多糖含量，mg；M为样品稀释倍数；W为样品质量，g；1 000为将mg转换为g。

表2 多糖提取条件优化正交试验因素与水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment for polysaccharides extraction conditions optimization

1.3.4 Sevag法除蛋白质[18]

取10 mL醇析后复溶的虫草多糖溶液，按1∶1、2∶1、3∶1体积比加入Sevag试剂（V氯仿/V正丁醇=2∶1），充分振荡40 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液，测定多糖含量和蛋白质含量（考马斯亮蓝G250染色法），计算蛋白去除率和多糖损失率。

式中：Ca为脱蛋白前蛋白含量，mg/mL；Cb为脱蛋白后蛋白含量，mg/mL。

式中：Cp1为脱蛋白前多糖含量，mg/mL；Cp2为脱蛋白后多糖含量，mg/mL。

2 结果与分析

2.1 碘显色法测定淀粉含量标准曲线

淀粉用纯水、质量分数为50%、65%和80%的Ca（NO3）2溶液所作标准曲线线性回归方程分别为Y=0.147X，Y=0.097X，Y=0.095X，Y=0.084X，相关系数R2均为0.999，表明4条标准曲线线性相关性都很高，可以分别用来计算相应样品中淀粉含量。

2.2 淀粉去除条件优化正交试验结果

正交试验结果表明，影响淀粉去除率的主次顺序为提取次数＞Ca（NO3）2质量分数＞料液比，直观分析确定最佳组合为A3B1C3，即Ca（NO3）2质量分数80%，料液比1∶20（g∶mL），提取3次，淀粉的去除率为42.57%。方差分析（表4）表明，Ca（NO3）2质量分数和提取次数对淀粉去除率的影响显著。

表3 淀粉去除条件优化正交试验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment for starch removal condition optimization

表4 淀粉去除正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of the starch removal orthogonal result

2.3 多糖提取条件优化正交试验结果

正交试验结果见表5，极差分析表明，影响多糖提取率的主次顺序为A（提取温度）＞C（提取时间）＞D（提取次数）＞B（料液比）；正交试验得出最优组合为A3B1C3D2，即料液比为1∶30（g∶mL）、浸提温度100 ℃、浸提3 h，提取2次，蛹虫草水溶性多糖的提取率最高，可达3.31%。由表6可知，方差分析表明各个因素在α=0.05水平上影响均不显著。

表5 蛹虫草多糖提取条件优化正交试验结果与分析Table 5 Results and analysis of orthogonal experiment for polysaccharides extraction conditions optimization

表6 多糖提取正交试验结果方差分析Table 6 Variance analysis of the polysaccharides extraction orthogonal result

2.4 Sevag法除蛋白质

图1 不同比例的多糖溶液与Sevag试剂的除蛋白结果Fig.1 Deproteinization results of different ratio of polysaccharides solution and Sevag regent

从图1可知，随着Sevag试剂用量的增加蛋白的去除率增大而多糖的损失率降低。多糖溶液与Sevag试剂的比例为1∶3（V/V）时，除蛋白1次蛋白的去除率为94.2%，多糖的损失率为20.95%。

3 结论

本研究采用Ca（NO3）2提取法去除蛹虫草培养基中的淀粉，采用质量分数为80%Ca（NO3）2按料液比1∶20（g∶mL）在100 ℃条件下水浴10 min，重复3次，淀粉的去除率达42.57%。由于淀粉与蛹虫草多糖的一些共性，采用一般方法分离二者较难，而采用本法浸提时间短，淀粉去除率高，同时可避免虫草多糖的过多损失，具有较高实用价值。

在成功除掉大量淀粉的基础上，进一步从培养基中提取蛹虫草多糖，正交试验表明，影响多糖提取率的主次顺序为A（提取温度）＞C（提取时间）＞D（提取次数）＞B（料液比）；正交试验得出最优试验组合为A3B1C3D2，即料液比为1∶30（g∶mL）、浸提温度100 ℃、浸提3 h，提取2次，提取率可达3.31%，通过单因素试验确定最佳脱蛋白条件为多糖溶液与Sevag试剂按1∶3比例混合，除蛋白1次。此时，蛋白的去除率可达94.2%，而多糖损失率为20.95%，效果较好。

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